喀麦隆接受 ART 治疗的 HIV-1 非 B 感染青少年中 HIV-1 病毒库的特征 (AVIR)

标题：喀麦隆接受抗逆转录病毒治疗的 HIV-1 非 B 型垂直感染青少年的病毒库特征。

缩写：AVIR 研究，青少年病毒库

重要性和相关性 撒哈拉以南非洲 (SSA) 受艾滋病毒/艾滋病影响尤为严重，占全球流行病的近 70%。 SSA 地区儿童艾滋病毒感染负担最高，每 10 名儿童中就有大约 9 名感染艾滋病毒(1, 2)。 全球艾滋病毒感染者中青少年和年轻人的比例越来越大。 2019年，约170万[110万-2.4 全球 10 至 19 岁之间的青少年感染艾滋病毒，约占所有艾滋病毒感染者的 5%，约 150 万 [1.0 - 210 万] 或 88% 的艾滋病毒感染青少年生活在 SSA。 仅2019年，就有46万[26万-68万]10至24岁的年轻人新感染艾滋病毒，其中17万[5.3万-34万]岁的10至19岁青少年。 雪上加霜的是，最新数据表明，在东部和南部非洲（受艾滋病毒影响最严重的地区），15-19 岁的青春期女孩和男孩中只有 27% 和 16% 在过去 12 个月内接受过艾滋病毒检测并接受了艾滋病毒检测。上次测试的结果。 西非、中非和南亚的检测率甚至更低。 如果目前的趋势继续下去，未来几年将有数十万人感染艾滋病毒，而在不了解自己状况的情况下，青少年将错过挽救生命的治疗。 此外，过去十年中大量围产期感染艾滋病毒的儿童正在进入青春期 (3)。 2019 年估计有 69 万人死于艾滋病相关疾病，其中 11 万人（约占 16%）是 20 岁以下的儿童。 （联合国儿童基金会全球和区域趋势，2020 年 7 月）。

随着抗逆转录病毒疗法 (ART) 的出现和扩展，全球与艾滋病相关的死亡人数有所下降。 截至 2019 年底，有 2540 万人正在接受抗逆转录病毒治疗，占艾滋病毒感染者总数的 67%。 然而，只有 53% 的艾滋病毒感染儿童接受了抗逆转录病毒治疗。 有趣的是，大约 94% 接受 ART 的儿童来自 SSA (4)。 在不断出现新的儿科艾滋病毒感染和儿科抗逆转录病毒治疗覆盖率不断提高的背景下，感染艾滋病毒的儿童数量将会增加，这表明如果治疗方案在控制艾滋病毒感染方面保持完全有效，则达到青春期甚至成年的可能性更高（3， 4). 因此，ADLHIV 构成了一个日益关注健康问题的艾滋病毒人群，并且针对该目标人群（特别是在SSA）的普遍最佳实践的发现非常有限。

与一些西非和中非国家一样，喀麦隆仍然面临着普遍的艾滋病毒流行病学问题（患病率为 2.7%）(5)，孕妇 (5.7%) 和暴露于艾滋病毒的婴儿/儿童 (5.8%) 的患病率较高 [958/16,638 ] 首次 PCR 阳性，PMTCT 级联结束时阳性 15%）(6)。 截至 2018 年 6 月，全国 ART 覆盖率为 51.5%（281,083 人），其中包括 12,362 名 15 岁以下儿童（6）。 关于喀麦隆对 ART 的反应，我们报告的病毒抑制总体率为 79.4%，不同年龄范围之间存在显着差异：成人为 81.1%，儿童为 75.6%，10-19 岁青少年仅为 53.3% (7)。 与联合国艾滋病规划署的报告类似，感染艾滋病毒的青少年 (ADLHIV) 是应对流行病最脆弱和服务不足的人群(1, 5)。 为了更安全地成长到成年，需要优先考虑这一人群，寻求创新的治疗策略，以确保他们的福祉并为 SSA 的发展做出贡献。

尽管 ART 的益处无可争议，但目前的治疗策略仍存在局限性。 值得注意的是，当前 ART 的终生性质伴随着大多数患者依从性相关的挑战，ART 引起的毒性和持续的免疫功能障碍对健康造成严重损害，HIV 耐药性 (HIVDR) 正在增加，主要是在大多数有 ART 经验的 SSA 国家病人还活着（8）。 在 HIVDR 的推动下，现有的抗逆转录病毒药物面临着新的艾滋病毒流行的威胁。 这些挑战对于儿科人群来说尤其如此，因为他们的抗逆转录病毒疗法选择有限、药物配方不佳以及随着他们进入青春期，不依从事件不断增加。 这些挑战需要采取艾滋病毒（功能性）治愈或缓解的方法，特别是对于最脆弱的人群（即最脆弱的人群）。 艾滋病病毒感染者 (ADL) (7, 9)。

支持该项目的概念包括想法、模型或假设 HIV-1 缓解或根除策略旨在在缺乏抗逆转录病毒治疗 (ART) 的情况下实现病毒缓解。 由于潜伏病毒库的存在，HIV-1 治疗方法的开发仍然具有挑战性。 HIV-1 潜伏库 (LR) 可定义为含有转录沉默原病毒 DNA 的细胞部分，这些 DNA 能够在激活后产生感染性病毒粒子 (10)。 静息记忆 CD4T 细胞是 LR 的主要宿主，但这些细胞中的 HIV-1 感染效率低下，因为它们的共受体表达较低且对逆转录有固有的限制 (11, 12)。 尽管如此，有证据表明 HIV-1 可以直接或通过细胞间传播感染静息 CD4T 细胞，尽管这些细胞的感染与较慢的复制动力学有关 (13)。 或者，当一部分受感染、激活的 CD4T 细胞恢复到静息记忆表型时，就会建立潜伏期，从而有效地沉默病毒基因表达，同时长期维持原病毒 DNA (14)。 原病毒通过宿主因素（例如表观遗传抑制、转录因子（例如 NF-κB）的耗竭以及由于整合到表达基因中而产生的转录干扰）在这些细胞中维持静止状态，对此进行了更详细的综述 (15)。 ART 停止后 LR 的病毒反弹很快，导致治疗中断后数周内可检测到病毒血症 (16)。 此外，在感染早期开始 ART 不足以阻止 LR 的形成，这表明 LR 很早就建立和传播（Chun 等人，1998 年；Whitney 等人，2014 年；Colby 等人，2018 年），甚至出生后不久就开始接受抗逆转录病毒治疗的垂直感染儿童 (17)。 尽管经过多年的抑制性 ART，潜伏病毒库仍保持稳定，并且是治疗中断后病毒血症反弹的根源。 因此，潜伏感染的细胞是 HIV-1 治愈的主要障碍，应通过新的治疗和根除策略专门针对这些细胞。

LR 的存在严重阻碍了 HIV-1 功能性或绝育疗法的开发进展。 目前，有两人的 HIV-1 感染已被治愈，即所谓的柏林和伦敦患者，自从接受 CCR5?32/?32 捐献者的同种异体干细胞移植以来，在超过 10 和 2 年的时间里，病毒反弹检测一直呈阴性。分别没有 ART 的年数 (18)。 在这些情况下，受感染的细胞库在移植前调理过程中显着减少，并被由于 CCR5 辅助受体大量缺失而对 R5 嗜性病毒感染具有抵抗力的供体细胞所取代 (19)。 由于CCR5 β32/β32 供体相对较少以及这些病例的独特情况，这种类型的治疗方法不适合广泛使用，但它确实强调了HIV-1治愈的基本原理；沉默或根除 HIV-1 LR (20)。 在过去的十年中，人们对艾滋病病毒在接受抗逆转录病毒疗法的个体中持续存在的位置和方式的理解发生了重大变化，有证据表明病毒持续存在于多种细胞类型和组织部位，以及静止和增殖的长寿命潜伏感染细胞中。 因此，在抑制治疗的框架内，准确估计病毒库将有助于更好地掌握病毒的持久性，从而可能克服实现治愈的现有障碍(21)。

总 HIV DNA 是一种参考生物标志物，包括整合和未整合的 HIV DNA，反映了病毒库的整体水平。 重要的是，Buzon 等人。报道了在首次接受早期感染治疗的成年人队列中，从 HIV 感染到开始治疗的时间与连续治疗 10 年后的 HIV DNA 总水平之间存在统计相关性 (22)。 在儿童中，当病毒在 1 岁之前得到控制时，HIV DNA 水平显着降低 (23)。 与其他标记物相比，HIV 总 DNA 的优点是易于通过标准化、灵敏的实时 PCR（包括数字微滴 PCR (ddPCR)）进行定量 (24)。

全身免疫激活是 HIV-1 感染的标志。 在这种状态下，多种免疫细胞表现出活化、增殖和凋亡标记物表达增加、细胞周期调节异常的细胞更新、促炎细胞因子的产生以及淋巴组织纤维化增加 (25)。 免疫激活与 HIV-1 疾病进展密切相关；例如，通过 CD38 和 HLA-DR 表达测量的 T 细胞活化比血浆病毒载量更能预测 CD4+T 细胞耗竭和较短的存活期 (26, 27)。 此外，通过 CD8+T 细胞激活测量的 HIV-1 感染早期免疫激活水平可预测 CD4+T 细胞损失，与血浆 HIV-1 RNA 水平无关 (28)。 通过有效的抗逆转录病毒治疗 (ART) 抑制病毒复制可减少免疫激活，但即使有效的 ART 方案也无法将 HIV 感染者的免疫激活水平降低至健康个体的水平 (25)。 感染艾滋病毒的儿童，即使成功接受了抗逆转录病毒治疗，也将终生面临免疫激活水平升高的问题。 因此，评估慢性免疫激活和炎症对发育中的免疫系统以及儿童艾滋病毒感染的疾病结果的潜在影响尤为重要。 最近的研究表明，免疫激活（HLA-DR、CD38）和耗竭标记（Tim-3、PD-1、Lag-3）与接受 ART 治疗的成人的病毒库大小密切相关，因此可以预期，最大限度地减少病毒感染早期抗逆转录病毒疗法可能同样可以最大限度地降低免疫激活水平以及与持续免疫激活相关的非艾滋病“衰老”疾病。

西非和中非地区 HIV 储存库特征的证据有限，该地区的 HIV-1 和 HIV-2 病毒株传播变异性最高 (29, 30)。 例如，喀麦隆是 HIV-1 的人畜共患病中心，是由 CRF02_AG 重组体驱动的广泛多样化的 HIV 景观的宿主，包括大多数 M 组（亚型）亚型、大量的 URF 和 CRF 以及 N 组， O、P 和 HIV-2 病毒(31-33)。 因此，在像喀麦隆这样的环境中，生成关于多个艾滋病毒分支的病毒库的基因型和定量特征的基线数据将为艾滋病毒治疗最佳策略的设计提供信息。 考虑到上述青少年垂直感染的脆弱性以及对该人群中病毒库和免疫激活/炎症反应的了解有限，从该目标产生的证据将与当前的全球努力高度补充。 这些证据是在合并感染高负担的背景下产生的 (34, 35)，可能描述了艾滋病毒持续存在的不同机制，与世界其他地区报道的机制截然不同。

前期工作：

在正在进行的 EDCTP READY-Study 框架内，我们建立了一个由 292 名垂直感染青少年（10-19 岁）组成的队列，在喀麦隆接受 ART。 在该队列中，我们报告了 ART 中位数 8 年后，病毒载量无法检测到的比率为 40%（<40 拷贝/mL），免疫学失败率（CD4<250 个细胞/mm3）约为 20%，临床失败率低于 10%。失败（即 世界卫生组织 III/IV 期) (36)。 该人群为了解病毒库的大小和性质、免疫反应/细胞因子分析的变异性、病毒亚型、治疗史（ART 方案和持续时间）、性别差异和依从水平对控制病毒的影响提供了独特的机会。病毒库。

目的：

本研究的目的是根据喀麦隆接受抗逆转录病毒治疗的垂直感染青少年的病毒学和免疫学特征来描述艾滋病毒储存库及其变异性，从而提高对病毒储存库的了解，并为艾滋病毒治疗研究提供准确可靠的数据。

具体的目标：

在本研究中，我们将： 1- 确定细胞储存库中的 HIV-1 遗传变异性和耐药性； 2- 描述垂直感染 HIV-1 的青少年的免疫激活/炎症特征； 3- 评估HIV储存库的大小； 4- 评估抗逆转录病毒治疗和免疫反应对病毒储存库的影响。

材料和方法 研究设计 我们计划对喀麦隆感染艾滋病毒并接受抗逆转录病毒疗法的青少年进行观察和比较研究。 参与者将从为 EDCTP-READY 研究招募的近 300 名垂直感染青少年的现有队列中进行选择和登记。

EDCTP-READY-Study 的主要目标是评估喀麦隆青少年接受一线和二线抗逆转录病毒治疗的治疗反应、耐药性和 HIV-1 变异性 (7)。 在这项研究中，我们招募了 296 名 HIV+ 青少年，并比较了循环 RNA 中的 HIV-1 基因型谱。 30% (89/296) APHI 经历病毒学失败（VL>1000 拷贝/mL）。

取样方法：

将根据资格标准从 EDCTP-READY 研究参与者采集血液样本。

资格标准：

纳入标准：将参加该研究，年龄为 10-19 岁、垂直感染、接受 ART 至少 12 个月的 HIV+ 青少年，并提供书面同意，其法定监护人提供书面代理同意。

不纳入标准：不考虑招募、不完整的 ART 病史、HBV/HCV 和疟疾合并感染的 HIV+ 青少年。

排除标准：在同意或无法提供血样后自行决定退出的任何参与者将被视为排除在研究之外。

样本量：研究的最小样本量（N）为90名参与者，根据以下公式计算：N=p（1-p）（Zα2/α2）； N = 0.02(1-0.02) (1.962/0.052) = 每臂 30 个（A 臂：VL<40 拷贝/mL；B 臂：VL 40-999 拷贝/mL；C 臂：病毒载量≥1000 拷贝/mL）。 P 是喀麦隆青少年艾滋病毒感染率，P=2% [3]； α 为风险，与 α = 5% 一致； Zα 是小间隙，Zα = 1.96。

注意：30 名 HIV 阴性青少年将作为免疫学分析的对照。

所有参与者都将被分配一个新的身份号码，数据将集中在尚塔尔比亚国际参考中心 (CIRCB) 的受密码保护的计算机中，用于艾滋病毒/艾滋病预防和管理的研究。

研究程序和变量 程序和时间表 本研究需要 18 个月才能完成：3 个月（第 1-3 个月）用于管理和伦理批准，12 个月（第 4 至 15 个月）用于参与者招募、采样和实验室分析，3个月（16 至 18 月）进行数据处理和报告，请参阅甘特图了解更多详细信息。

根据纳入标准，将从 EDCTP-READY 研究中选择 HIV+ 青少年病例报告表，并联系其法定监护人。 将分别获得青少年和法定监护人的同意和代理知情同意。 在 EDCTP-READY 研究入组期间，将再次评估社会人口统计、临床数据和 ART 历史。 然后将招募 90 名或更多 HIV+ 青少年 [每组 30 名（A 组：VL<40 拷贝/mL；B 组：VL 40-999 拷贝/mL；C 组：病毒载量≥1000 拷贝/mL）] 。 将招募 30 名 HIV 阴性青少年作为免疫学分析的对照。 静脉血 (5ml x 2) 将由经过培训的抽血师收集用于实验室分析，包括 PBMC 分离、血浆和血沉棕黄层分离、CD4/CD8 计数、血浆病毒载量 (PVL)、免疫激活/炎症标志物评估、HIV-RNA 和HIV-DNA 基因分型、病毒库定量。

HIV 阴性参与者将在 CIRCB 招募，该机构自 2006 年以来一直是管理 HIV 感染者的参考中心，因此也是著名的 HIV 检测参考中心。 基于这一优势，CIRCB每年为多个机构和社区组织免费的HIV/HBV/HCV筛查测试，因此，将在附近的一所中学组织类似的免费测试活动，并将本研究呈现给那些符合纳入标准的人。 潜在参与者将被邀请与其法定监护人一起到 CIRCB 报名。

样本以及所有相关的社会人口统计和临床数据仅在登记时收集一次。 样品将在同一天运送到 CIRCB，进行 PBMC 分离、DNA、血浆和血沉棕黄层分离、CD4/CD8 计数以及使用流式细胞术评估激活/炎症标记物。 血浆将被收集并储存在 -80oC 下，用于使用 ELISA 测试（或流式细胞术）进行血浆病毒载量 (PVL)、基因分型、免疫激活/炎症标记物评估。 随后将从 PBMC 中提取 HIV-DNA 并保存在 -80oC 下； HIV-DNA 将每三个月运送至意大利罗马罗马大学实验医学系，用于 HIV 病毒库定量（参见附件部分中的合作函）。

实验室程序 CD4/CD8 计数：CD4/CD8 测量值将使用流式细胞仪测定，如前所述 (37)。

血浆病毒载量：血浆病毒载量将使用 m 2000rt Abbott 实时系统测定，如前所述 (38)。

HIV-RNA 提取：按照制造商的说明，使用 Qiamp 病毒 RNA Mini Kit (Qiagen) 从血浆样本中提取 ARN。

从血沉棕黄层中提取前病毒 DNA：按照制造商的描述，使用 DNeasy 血液和组织提取试剂盒（Qiagen）提取前病毒 DNA。

PBMC 分离：将使用 Ficoll 使用内部方案通过密度梯度离心分离 PBMC。

从 PBMC 中提取 HIV-DNA：将按照制造商的说明使用 QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) 提取 HIV-DNA。

HIV-1 基因扩增和测序：正如我们的研究小组先前所述(39)，将对经历病毒学失败的青少年进行内部方案的 HIV-1 耐药性检测的桑格测序 (Sanger Sequence)。 将使用斯坦福大学数据库基因型耐药性解释算法 (www.stanford.edu) 分析逆转录酶 DNA 序列的耐药性突变。

系统发育分析：将使用 MEGA 软件（Kimura 2 参数模型，200 次 bootstrap 复制）和 FigTree (40, 41) 创建邻接系统发育树。

免疫分析：将使用商业 ELISA 试剂盒和流式细胞术评估免疫激活/炎症细胞因子（IL-1、IL2、IL4、IL6、IL10、IL12 和 TNF-α）。

HIV 病毒库的定量：如前所述，将使用液滴数字 PCR (ddPCR) 对病毒库进行定量。 值得注意的是，这一量化将在意大利罗马罗马托尔维加塔大学实验医学系进行，如本提案附件中的合作信所述。 在将样品运送到 UTV 之前，CIRCB 和 UTV 之间将签署材料转让和数据共享协议。 这是针对 HIV-1 B 亚型的内部方案，并将根据喀麦隆样本中预期的 HIV-1 非 B 亚型进行调整。

数据分析 研究期间收集的数据将使用 SPSS 软件进行分析。 将使用多元逻辑回归来评估相关因素，并采用不同参数的无偏效应的估计方法。 数据将报告为中位数。 非正态分布的数据将使用非参数检验，不同组之间中位数的比较（病毒学成功与病毒学失败）将通过 U-Mann-Whitney 检验进行。 将通过 Spearman 检验进行相关性分析，p 值小于 0.05 将被认为具有统计显着性。

伦理考虑 本研究将根据赫尔辛基关于涉及人类受试者的医学研究的伦理原则宣言进行。 人类健康研究将获得喀麦隆国家伦理委员会的伦理审查。 在收到有关研究的知情通知后，将从法定监护人处获得书面委托书，并且还将从参与的艾滋病毒+青少年处获得书面同意，而无需任何胁迫。 通过使用唯一标识符和密码保护的数据库，将确保隐私和机密性，并且只有授权人员才能访问。 参与者可以随时自愿退出研究，而不会对他们在研究诊所的常规监测产生任何影响。 放血术将是非侵入性的（静脉穿刺），并将由经过培训的护士进行。

质量保证：

我们的研究团队将包括一名质量保证官员，他将负责研究方案的所有 SOP，并在整个研究期间管理能力验证和数据验证。

潜在风险的管理：患者面临的风险很小，因为志愿者接受的唯一手术是由抽血师或医生进行静脉穿刺。 静脉穿刺可能会有点痛，但实际上没有并发症的风险。 对受试者的潜在风险（这些风险都不太可能发生）可能包括短暂的疼痛、部位瘀伤或可能（但极不可能）的感染。 如果出现此类并发症，将为参与者提供紧急医疗救治。