Karakterisering av HIV-1-reservoarer hos HIV-1-ikke-B-infiserte ungdommer på ART i Kamerun (AVIR)

Tittel: Karakterisering av virale reservoarer blant HIV-1 ikke-B vertikalt infiserte ungdommer som mottar antiretroviral terapi i Kamerun.

Akronym: AVIR-studie, Adolescent viralt reservoar

Viktighet og relevans Afrika sør for Sahara (SSA) er uforholdsmessig rammet av HIV/AIDS, med nærmere 70 % av de globale epidemiene. Med den høyeste byrden av pediatriske HIV-infeksjoner, fant omtrent ni av hver 10 barn som lever med HIV i SSA-regionen(1, 2). Ungdom og unge representerer en økende andel av mennesker som lever med hiv over hele verden. I 2019 var rundt 1,7 millioner [1,1 millioner-2,4 millioner] ungdommer mellom 10 og 19 år levde med HIV over hele verden, noe som representerer omtrent 5 % av alle mennesker som lever med HIV, omtrent 1,5 millioner [1,0 - 2,1 millioner] eller 88 % av HIV-smittede ungdommer bor i SSA. Bare i 2019 ble 460 000 [260 000-680 000] unge i alderen 10 til 24 nylig smittet med HIV, hvorav 170 000 [53 000-340 000] var ungdommer mellom 19 og 19 år. For å forsterke dette indikerer de nyeste data at bare 27 % av ungdomsjenter og 16 % av ungdomsgutter i alderen 15–19 i Øst- og Sør-Afrika – regionen som er mest berørt av HIV – har blitt testet for HIV de siste 12 månedene og mottatt resultatet av den siste testen. Testratene i Vest- og Sentral-Afrika og Sør-Asia er enda lavere. Hvis dagens trender fortsetter, vil hundretusener flere bli HIV-positive i de kommende årene, og uten å vite statusen deres, vil ungdom gå glipp av livreddende behandling. I tillegg har en stor populasjon av barn infisert med HIV perinatalt i løpet av det siste tiåret vokst inn i ungdomsårene (3). Av de estimerte 690 000 menneskene som døde av AIDS-relaterte sykdommer i 2019, var 110 000 (eller omtrent 16 %) av dem barn under 20 år. (UNICEF globale og regionale trender, juli 2020).

Med fremkomsten og skalerbarheten til antiretroviral terapi (ART), er det en global nedgang i AIDS-relaterte dødsfall. Ved utgangen av 2019 hadde 25,4 millioner mennesker tilgang til antiretroviral terapi, noe som representerer 67 % av alle mennesker som lever med HIV. Imidlertid fikk bare 53 % av barna som levde med HIV ART. Interessant nok er omtrent 94 % av alle barn som mottar ART fra SSA (4). I denne sammenheng med kontinuerlige nye HIV-infeksjoner hos barn og økende dekning innen pediatrisk ART, vil antallet barn som lever med HIV øke, noe som tyder på en høyere sannsynlighet for å nå ungdomsalder og til og med voksen alder dersom behandlingsregimene forblir fullt effektive for å kontrollere HIV-infeksjon (3, 4). ADLHIV utgjør derfor en HIV-populasjon med økende helseproblemer og med svært begrensede funn for generaliserbare beste praksiser spesifikke for denne målgruppen, spesielt i SSA.

Som flere vest- og sentralafrikanske land, står Kamerun fortsatt overfor en generalisert HIV-epidemiologi (2,7 % prevalens) (5), med høyere prevalens blant gravide kvinner (5,7 %) og HIV-eksponerte spedbarn/barn (5,8 % [958/16 638) ] positivitet ved første PCR og 15 % ved slutten av PMTCT-kaskaden) (6). Fra juni 2018 var den nasjonale dekningen av ART 51,5 % (281 083), som inkluderer 12 362 barn under 15 år (6). Når det gjelder respons på ART i Kamerun, rapporterte vi en total rate på 79,4 % viral undertrykkelse, med betydelige forskjeller på tvers av aldersgrupper: 81,1 % hos voksne, 75,6 % hos barn og bare 53,3 % hos ungdom i alderen 10-19 år (7). I likhet med UNAIDS-rapporter representerer ungdommer som lever med HIV (ADLHIV) den mest sårbare og undertjente befolkningen som svar på epidemiene (1, 5). For en tryggere vekst mot voksen alder, er det behov for å prioritere denne befolkningen for søken etter innovative behandlingsstrategier som sikrer deres velvære og deres bidrag til utviklingen av SSA.

Til tross for de ubestridte fordelene med ART, er det begrensninger med dagens behandlingsstrategier. Det er verdt å merke seg at den livslange karakteren til nåværende ART går med utfordringsrelatert overholdelse for de fleste pasienter, ART-tilskrevet toksisitet og vedvarende immundysfunksjon har betydelige helsesvikt, og HIV-medisinresistens (HIVDR) øker, hovedsakelig i SSA-land der de fleste ART-erfarne pasienter lever (8). Det er en trussel om en ny HIV-epidemi, drevet av HIVDR til eksisterende antiretrovirale midler. Disse utfordringene gjelder spesielt for pediatriske populasjoner på grunn av begrensede ART-alternativer, dårlige legemiddelformuleringer og økende hendelser med manglende overholdelse etter hvert som de vokser mot ungdomsårene. Disse utfordringene krever tilnærminger til HIV (funksjonell) kur eller remisjon, spesielt for de mest sårbare befolkningene (dvs. ADLHIV) (7, 9).

Konsepter som underbygger prosjektet, inkludert ideer og modeller eller antakelser HIV-1-remisjon eller utryddelsesstrategier tar sikte på å oppnå viral remisjon i fravær av antiretroviral terapi (ART). Utviklingen av en HIV-1-kur er fortsatt utfordrende på grunn av de latente reservoarene. HIV-1 Latent Reservoir (LR) kan defineres som fraksjonen av celler som inneholder transkripsjonelt stille proviralt DNA som er i stand til å produsere infeksiøse virioner etter aktivering(10). Hvilende minne CD4T-celler er den primære verten for LR, men HIV-1-infeksjon i disse cellene er ineffektiv på grunn av deres lave ko-reseptoruttrykk og iboende restriksjoner for revers transkripsjon (11, 12). Likevel er det bevis på at HIV-1 kan infisere hvilende CD4T-celler direkte eller via celle-til-celle-overføring, selv om infeksjon i disse cellene er assosiert med langsommere replikasjonskinetikk (13). Alternativt etableres latens når en undergruppe av infiserte, aktiverte CD4T-celler går tilbake til en hvilende minnefenotype, som effektivt demper viralt genuttrykk samtidig som det opprettholder det provirale DNAet på lang sikt(14). Proviruset opprettholdes i en stillestående tilstand i disse cellene via vertsfaktorer som epigenetisk undertrykkelse, uttømming av transkripsjonsfaktorer som NF-KB og transkripsjonsinterferens på grunn av integrering i uttrykte gener, gjennomgått mer detaljert (15). Viral rebound fra LR etter seponering av ART er rask, noe som fører til påvisbar viremi innen uker etter behandlingsavbrudd (16). I tillegg er initiering av ART tidlig i infeksjon ikke tilstrekkelig til å stoppe dannelsen av LR, noe som tyder på at LR etableres og spres tidlig (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), selv hos vertikalt infiserte barn som startet ART like etter fødselen (17). Det latente reservoaret er stabilt til tross for mange år med undertrykkende ART og er kilden til rebound-viremi etter behandlingsavbrudd. Latent infiserte celler representerer derfor hovedbarrieren for en HIV-1-kur og bør spesifikt målrettes av nye behandlings- og utryddelsesstrategier.

Fremgangen mot utviklingen av en funksjonell eller steriliserende kur for HIV-1 har blitt betydelig hindret av tilstedeværelsen av LR. For tiden har to personer blitt kurert for HIV-1-infeksjon, de såkalte Berlin- og London-pasientene, som siden de mottok allogene stamcelletransplantasjoner fra CCR5?32/?32-givere, konsekvent har testet negativt for viral rebound i over 10 og 2 ganger. år, henholdsvis uten ART (18). I disse tilfellene ble den infiserte cellepoolen betydelig utarmet under pre-transplantasjonskondisjonering og erstattet med donorceller som er resistente mot infeksjon med R5-tropisk virus på grunn av en stor delesjon i CCR5-koreseptoren (19). På grunn av den relative mangelen på CCR5 ?32/?32-givere og de unike omstendighetene som forhåndsbestemmer disse tilfellene, er denne typen kur ikke mulig for utbredt bruk, den understreker imidlertid det grunnleggende prinsippet for HIV-1-kur; dempe eller utrydde HIV-1 LR (20). I løpet av det siste tiåret har forståelsen av hvor og hvordan HIV vedvarer hos individer på ART endret seg betydelig med bevis for at viruset vedvarer i flere celletyper og vevssteder, og i både hvilende og prolifererende langlivede latent infiserte celler. Således, innenfor rammen av en undertrykkende behandling, vil nøyaktige estimater av virusreservoaret hjelpe til med en bedre mestring av viral persistens, som igjen kan overvinne eksisterende barrierer for å oppnå en kur(21).

Total HIV-DNA er en referansebiomarkør som inkluderer både integrert og uintegrert HIV-DNA og reflekterer det globale nivået til virusreservoaret. Det er viktig at Buzon et al. rapporterte en statistisk korrelasjon mellom tiden fra HIV-infeksjon til behandlingsstart og det totale HIV-DNA-nivået etter 10 års kontinuerlig behandling i en kohort av voksne først behandlet med tidlig infeksjon (22). Hos barn var HIV-DNA-nivået markant lavere når viruskontroll ble oppnådd før 1 års alder (23). Sammenlignet med andre markører har total HIV-DNA fordelen av enkel kvantifisering ved standardisert, sensitiv, sanntids-PCR, inkludert digital dråpe-PCR (ddPCR) (24).

Generalisert immunaktivering er et kjennetegn på HIV-1-infeksjon. I denne tilstanden viser en rekke immunceller en økning i uttrykk for aktivering, proliferasjon og apoptotiske markører, cellulær omsetning med avvikende cellesyklusregulering, produksjon av pro-inflammatoriske cytokiner og økt lymfoidvevsfibrose (25). Immunaktivering er sterkt assosiert med HIV-1 sykdomsprogresjon; for eksempel er T-celleaktivering, målt ved ekspresjon av CD38 og HLA-DR, mer prediktiv for utarming av CD4+T-celler og kortere overlevelse enn plasmavirusmengden (26, 27). Videre predikerer nivået av immunaktivering tidlig i HIV-1-infeksjon, målt ved CD8+T-celleaktivering, tap av CD4+T-celler uavhengig av plasma HIV-1 RNA-nivåer (28). Undertrykkelse av viral replikasjon med effektiv antiretroviral behandling (ART) reduserer immunaktivering, men selv effektive ART-regimer er ikke i stand til å redusere nivåene av immunaktivering hos HIV-infiserte individer til nivåer sett hos friske individer (25). HIV-infiserte barn, selv om de behandles med ART, står overfor en levetid med forhøyet immunaktivering. Evaluering av den potensielle effekten av kronisk immunaktivering og betennelse på det utviklende immunsystemet og på sykdomsutfall ved pediatrisk HIV-infeksjon er derfor av spesiell betydning. Nyere studier viste at immunaktivering (HLA-DR, CD38) og utmattelsesmarkører (Tim-3, PD-1, Lag-3) er sterkt assosiert med reservoarstørrelse hos ART-behandlede voksne, og derfor kan det forventes at minimering av viruset reservoar med tidlig ART kan på samme måte minimere nivået av immunaktivering og ikke-AIDS "aldrende" sykdommer forbundet med vedvarende immunaktivering.

Det er begrenset evidens for å karakterisere HIV-reservoarer i den vestlige og sentralafrikanske regionen, en geografisk setting med størst variasjon i sirkulerende HIV-1- og HIV-2-stammer (29, 30). For eksempel er Kamerun, et zoonotisk episenter av HIV-1, vert for et omfattende mangfoldig landskap av HIV drevet av CRF02_AG rekombinanten, inkludert de fleste gruppe M (sub-) subtyper, et stort utvalg av URF og CRF, og gruppe N, O, P og HIV-2 virus(31-33). Generering av grunnlinjedata om den genotypiske og kvantitative profilen til det virale reservoaret på tvers av flere HIV-klader i omgivelser som Kamerun vil derfor informere utformingen av optimale strategier for HIV-kur. Tatt i betraktning den nevnte sårbarheten til ungdom med vertikal infeksjon og den begrensede kunnskapen om virale reservoarer og immunaktivering/inflammatorisk reaksjon i denne populasjonen, vil bevis generert fra dette målet være svært komplementære til dagens globale innsats. Slike bevis, generert i en kontekst med høy belastning av ko-infeksjoner (34, 35), kan skildre differensielle mekanismer for HIV-persistens langt fra de som er rapportert i andre deler av verden.

Forarbeid:

Innenfor rammen av den pågående EDCTP READY-studien har vi satt opp en kohort på 292 vertikalt infiserte ungdommer (10-19 år) som mottar ART i Kamerun. I denne kohorten rapporterte vi en rate på 40 % uoppdagbar viral belastning (<40 kopier/ml) etter en median på 8 år med ART, omtrent 20 % immunologisk svikt (CD4<250 celler/mm3) og mindre enn 10 % klinisk feil (dvs. WHO stadier III/IV) (36). Denne populasjonen tilbyr en unik mulighet for å forstå størrelsen og naturen til reservoaret, variasjonen av immunrespons/cytokinprofilering, og effekten av viral subtype, behandlingshistorie (ART-regime og varighet), kjønnsforskjeller og adherensnivå på kontrollen av viralt reservoar.

MÅL:

Målet med denne studien er å karakterisere HIV-reservoarer og deres variasjon i henhold til virologiske og immunologiske profiler til vertikalt infiserte ungdommer som mottar antiretroviral terapi i Kamerun, og derfor forbedre forståelsen av virale reservoarer og gi nøyaktige og pålitelige data for HIV-kurforskning.

Spesifikke mål:

I denne studien skal vi: 1- Bestemme HIV-1 genetisk variasjon og medikamentresistens i cellulære reservoarer; 2- Karakterisere immunaktivering/betennelse hos ungdom vertikalt infisert med HIV-1; 3- Evaluer størrelsen på HIV-reservoaret; 4- Evaluer effekten av antiretroviral terapi og immunrespons på den virale reservoarprofilen.

Materialer og metoder Studiedesign Vi planlegger å gjennomføre en observasjons- og komparativ studie blant ungdom som lever med HIV og mottar ART i Kamerun. Deltakerne vil bli valgt og registrert fra en eksisterende kohort på nærmere 300 vertikalt infiserte ungdommer rekruttert til EDCTP-READY-studien.

Hovedmålet med EDCTP-READY-studien var å evaluere behandlingsrespons, medikamentresistens og HIV-1 variasjon blant ungdom på første- og andrelinje antiretroviral behandling i Kamerun (7). I denne studien rekrutterte vi 296 HIV+ ungdommer og sammenlignet HIV-1 genotypisk profil i sirkulerende RNA. Av 30 % (89/296) APHI som opplever virologisk svikt (VL>1000 kopier/ml).

Prøvemetode:

Blodprøver vil bli samlet inn fra deltakere i EDCTP-READY-studien i henhold til kvalifikasjonskriteriene.

Kvalifikasjonskriterier:

Inklusjonskriterier: Vil bli registrert i studien, HIV+-ungdom i alderen 10-19 år, vertikalt infisert, har vært på ART i minst 12 måneder, som gir sitt skriftlige samtykke og hvis juridiske verge gir skriftlig fullmaktssamtykke.

Ikke-inkluderingskriterier: Vil ikke bli vurdert for påmelding, HIV+-ungdom med ufullstendig ART-historie, HBV/HCV og malaria-konfeksjoner.

Eksklusjonskriterier: Vil bli ansett som ekskludert fra studien, enhver deltaker som bestemmer seg fritt for å trekke seg etter å ha gitt samtykke eller ute av stand til å gi blodprøve.

Prøvestørrelse: Minimum prøvestørrelse (N) for studien er 90 deltakere, beregnet ut fra følgende formel: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 per arm (arm-A: VL<40 kopier/ml; arm-B: VL 40-999 kopier/ml; arm-C: viral belastning ≥1000 kopier/ml). P er prevalensen av ungdommer som lever med HIV i Kamerun med P=2 % [3]; α er risikoen samsvarer med α = 5 %; Zα er det lille gapet med Zα = 1,96.

NB: En gruppe på 30 HIV-negative ungdommer vil fungere som kontroll for immunologisk profilering.

Alle deltakere vil bli tildelt et nytt identifikasjonsnummer og data vil bli sentralisert i en passordbeskyttet datamaskin ved det internasjonale referansesenteret Chantal Biya (CIRCB) for forskning på HIV/AIDS-forebygging og -håndtering.

Studieprosedyrer og variabler Prosedyrer og tidslinjer Denne studien krever 18 måneder for å fullføres: 3 måneder (måned 1-3) for administrasjon og etikkgodkjenning, 12 måneder (måned 4 til 15) for innmelding av deltakere, prøvetaking og laboratorieanalyser, 3 måneder (måned 16 til 18) for databehandling og rapportering, se Gantt-diagram for flere detaljer.

Basert på inklusjonskriterier, vil case-rapportskjemaer for HIV+-ungdom velges fra EDCTP-READY-studien, og deres juridiske verge vil bli kontaktet. Samtykke og fullmektig-informert samtykke vil bli innhentet fra henholdsvis ungdom og verge. Sosiodemografiske, kliniske data og ART-historie vil bli vurdert på nytt for perioden under påmelding til EDCTP-READY-studien. Deretter vil 90 eller flere HIV+-ungdom [30 per arm (arm-A: VL<40 kopier/ml; arm-B: VL 40-999 kopier/ml; arm-C: virusmengde ≥1000 kopier/ml)] bli registrert . En gruppe på 30 HIV-negative ungdommer vil bli registrert for å tjene som kontroll for immunologisk profilering. Intravenøst ​​blod (5 ml x 2) vil bli samlet inn av en utdannet phlebotomist for laboratorieanalyser, inkludert PBMC-isolering, plasma- og buffy coat-isolering, CD4/CD8-teller, plasmatisk viral belastning (PVL), immunaktivering / inflammatoriske markører vurdering, HIV-RNA og HIV-DNA genotyping, kvantifisering av virale reservoarer.

HIV-negative deltakere vil bli rekruttert ved CIRCB, denne institusjonen er et referansesenter for håndtering av HIV-smittede individer siden 2006, og er som sådan et kjent referansesenter for HIV-testing. Basert på denne fordelen organiserer CIRCB gratis HIV/HBV/HCV screeningtester for flere institusjoner og lokalsamfunn per år, derfor vil en lignende gratis testkampanje bli organisert på en ungdomsskole i nærheten, og denne studien vil bli presentert for de som oppfyller inklusjonskriteriene . Potensielle deltakere vil bli invitert til CIRCB med sin juridiske verge for påmelding.

Prøver vil kun bli samlet inn én gang ved påmelding, samt alle relevante sosiodemografiske og kliniske data. Prøver vil bli transportert til CIRCB samme dag for PBMC-isolering, DNA-, plasma- og buffy coat-isolering, CD4/CD8-tellinger og vurdering av aktiverings-/inflammatoriske markører ved bruk av flowcytometri. Plasma vil bli samlet inn og lagret ved -80oC for plasmatisk viral belastning (PVL), genotyping, immunaktivering / inflammatoriske markører vurdering ved bruk av ELISA-tester (eller flowcytometri). HIV-DNA vil deretter bli ekstrahert fra PBMCer og lagret ved -80oC; HIV-DNA vil bli sendt hver tredje måned til avdelingen for eksperimentell medisin, Universitetet i Roma Tor Vergata, Roma, Italia, for kvantifisering av HIV viral reservoar (se samarbeidsbrev i vedleggsdelen).

Laboratorieprosedyrer CD4/CD8-tall: CD4/CD8-målinger vil bli bestemt ved bruk av flowcytometrimaskin som tidligere beskrevet (37).

Plasma viral belastning: Plasma viral belastning vil bli bestemt ved å bruke m 2000rt Abbott sanntidssystem som tidligere beskrevet (38).

HIV-RNA-ekstraksjon: ARN vil bli ekstrahert fra plasmaprøver ved bruk av Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) som beskrevet av produsenten.

Pro-viral DNA-ekstraksjon fra buffy coat: Pro-viral DNA vil bli ekstrahert ved hjelp av DNeasy blod- og vevsekstraksjonssett (Qiagen) som beskrevet av produsenten.

PBMC-isolasjon: PBMC-er vil bli isolert ved tetthetsgradientsentrifugering ved bruk av Ficoll ved bruk av en intern protokoll.

HIV-DNA-ekstraksjon fra PBMCer: HIV-DNA vil bli ekstrahert ved hjelp av QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) som beskrevet av produsenten.

HIV-1 gener amplifikasjon og sekvensering: Sanger-sekvensering for HIV-1 medikamentresistenstesting vil bli utført for ungdom som opplever virologisk svikt en intern protokoll, som tidligere beskrevet av vår forskningsgruppe(39). Revers transkriptase DNA-sekvenser vil bli analysert for medikamentresistensmutasjoner ved å bruke Stanford Universitys database genotypisk resistenstolkningsalgoritme (www.stanford.edu).

Fylogenetisk analyse: Nabofelling fylogenetiske trær vil bli opprettet ved hjelp av MEGA-programvare (Kimura 2-parameter modell, 200 bootstrap replikasjoner) og FigTree (40, 41).

Immunprofilering: Både immunaktivering/inflammatoriske cytokiner (IL-1, IL2,IL4, IL6, IL10, IL12 og TNF-alfa) vil bli vurdert ved bruk av kommersielle ELISA-sett og flowcytometri.

Kvantifisering av HIV-virale reservoarer: virale reservoarer vil kvantifiseres ved bruk av droplet digital PCR (ddPCR) som tidligere beskrevet. Merk at denne kvantifiseringen vil bli utført i avdelingen for eksperimentell medisin, Universitetet i Roma Tor Vergata, Roma, Italia som angitt i samarbeidsbrevet i vedlegget til dette forslaget. En materialoverføring og en datadelingsavtale vil bli signert mellom CIRCB og UTV før prøveforsendelse til UTV. Det er en intern protokoll for HIV-1 B-subtype og vil bli justert for HIV-1 ikke-B-subtyper som forventes fra kamerunske prøver.

Dataanalyse Data som samles inn under studien vil bli analysert ved hjelp av SPSS-programvare. Tilknyttede faktorer vil bli evaluert ved hjelp av multivariat logistisk regresjon, med en estimattilnærming for den objektive effekten av ulike parametere. Dataene vil bli rapportert som median. Ikke-parametriske tester vil bli brukt for data som ikke er normalfordelt, sammenligninger av medianer mellom ulike grupper (virologisk suksess vs virologisk svikt) vil bli utført med U-Mann-Whitney-testen. Korrelasjoner vil bli gjort med Spearman-testen og p-verdier mindre enn 0,05 vil bli vurdert som statistisk signifikante.

Etiske betraktninger Denne studien vil bli utført i henhold til Helsinki-erklæringen om etiske prinsipper for medisinsk forskning som involverer mennesker. Etisk godkjenning vil bli innhentet fra Kameruns nasjonale etiske komité for forskning på menneskers helse. etter en informert melding om studien, vil en skriftlig fullmektig-informert bli innhentet fra verge, og en skriftlig samtykke vil også bli innhentet fra deltakende HIV+-ungdom, uten noen form for tvang. Personvern og konfidensialitet vil bli sikret, gjennom bruk av unike identifikatorer og en passordbeskyttet database, og vil kun få tilgang til autorisert personale. Deltakerne vil stå fritt til å bevisst forlate studien når som helst, uten noen innvirkning på deres rutinemessige overvåking ved studieklinikken. Flebotomi vil være ikke-invasiv (venepunktur) og vil bli utført av en utdannet sykepleier.

Kvalitetssikring:

Vårt studieteam vil inkludere en kvalitetssikringsansvarlig som vil være ansvarlig for alle SOP-er for studieprotokollen og vil administrere ferdighetstesting og datavalidering under hele studien.

Håndtering av potensielle risikoer: Risikoen for pasientene er minimal, siden den eneste prosedyren den frivillige utsettes for er venepunktur av en phlebotomist eller lege. Venepunkturen kan være lett smertefull, men er praktisk talt uten risiko for komplikasjoner. Den potensielle risikoen for forsøkspersoner, hvorav ingen sannsynligvis vil oppstå, kan omfatte øyeblikkelig smerte, blåmerker på stedet eller mulig (men ekstremt usannsynlig) infeksjon. Dersom slike komplikasjoner oppstår, vil deltakeren få akutt medisinsk behandling.