HIV-1-varastojen karakterisointi HIV-1-tartunnan saamattomilla nuorilla ART:lla Kamerunissa (AVIR)

Otsikko: Kamerunissa antiretroviraalista hoitoa saavien HIV-1:n ei-B-virustartunnan saaneiden nuorten virusvarastojen karakterisointi.

Lyhenne: AVIR-study, Adolescent virus reservoir

Tärkeys ja merkitys Saharan eteläpuolisessa Afrikassa (SSA) hiv/aids vaikuttaa suhteettoman paljon, ja lähes 70 prosenttia maailmanlaajuisista epidemioista. Suurin lasten HIV-tartuntataakka, noin yhdeksän kymmenestä HIV-tartunnan saaneesta lapsesta löytyy SSA-alueella(1, 2). Nuoret ja nuoret edustavat kasvavaa osuutta HIV-tartunnan saaneista maailmanlaajuisesti. Vuonna 2019 noin 1,7 miljoonaa [1,1 miljoonaa-2,4 miljoonaa] 10–19-vuotiasta nuorta eli noin 5 % kaikista HIV-tartunnan saaneista ihmisistä, noin 1,5 miljoonaa [1,0 - 2,1 miljoonaa] eli 88 % HIV-tartunnan saaneista nuorista asuu SSA:ssa. Pelkästään vuonna 2019 460 000 [260 000–680 000] 10–24-vuotiasta nuorta sai äskettäin HIV-tartunnan, joista 170 000 [53 000–340 000] oli iältään 10–19-vuotiaita nuoria. Tämän lisäksi uusimmat tiedot osoittavat, että vain 27 prosenttia 15–19-vuotiaista teini-ikäisistä tytöistä ja 16 prosenttia 15–19-vuotiaista pojista Itä- ja Etelä-Afrikassa - HIV:n eniten kärsineellä alueella - on testattu HIV-testin varalta viimeisten 12 kuukauden aikana ja saanut viimeisen testin tulos. Länsi- ja Keski-Afrikassa sekä Etelä-Aasiassa testausasteet ovat vielä alhaisemmat. Jos nykytrendit jatkuvat, satojatuhansia lisää HIV-positiivisia tulee tulevina vuosina, ja nuoret jäävät ilman hengenpelastushoitoa tietämättä heidän asemaansa. Lisäksi suuri joukko lapsia, jotka ovat saaneet HIV-tartunnan perinataalisesti viimeisen vuosikymmenen aikana, on kasvamassa murrosikäisiksi (3). Vuonna 2019 AIDSiin liittyviin sairauksiin kuolleista arviolta 690 000 ihmisestä 110 000 (eli noin 16 %) oli alle 20-vuotiaita lapsia. (UNICEF globaalit ja alueelliset trendit, heinäkuu 2020).

Antiretroviraalisen hoidon (ART) käyttöönoton ja skaalautuvuuden myötä AIDSiin liittyvät kuolemat vähenevät maailmanlaajuisesti. Vuoden 2019 lopussa 25,4 miljoonaa ihmistä sai antiretroviraalista hoitoa, mikä on 67 prosenttia kaikista HIV-tartunnan saaneista ihmisistä. Kuitenkin vain 53 % HIV:tä sairastavista lapsista sai ART. Mielenkiintoista on, että noin 94 % kaikista ART-hoitoa saavista lapsista on SSA:sta (4). Tässä yhteydessä jatkuvasti uusien lasten HIV-infektioiden ja lasten ART-hoidon kattavuuden lisääntyessä HIV-tartunnan saaneiden lasten määrä kasvaa, mikä viittaa suurempaan todennäköisyyteen saavuttaa murrosikä ja jopa aikuisuus, jos hoito-ohjelmat pysyvät täysin tehokkaina HIV-infektion hallinnassa (3, 4). ADLHIV muodostaa siksi HIV-populaation, jonka terveysongelmat kasvavat ja jolla on hyvin vähän havaintoja yleistettävistä parhaista käytännöistä, jotka koskevat tätä kohderyhmää, erityisesti SSA:ssa.

Kuten useat Länsi- ja Keski-Afrikan maat, Kamerunissa on edelleen yleinen HIV-epidemiologia (2,7 %:n esiintyvyys) (5) ja suurempi esiintyvyys raskaana olevilla naisilla (5,7 %) ja HIV:lle altistuneilla imeväisillä/lapsilla (5,8 % [958/16 638) ] positiivisuus ensimmäisessä PCR:ssä ja 15 % PMTCT-kaskadin lopussa) (6). Kesäkuussa 2018 ART-kattavuus oli 51,5 % (281 083), johon kuuluu 12 362 alle 15-vuotiasta lasta (6). Mitä tulee vasteeseen ART-hoitoon Kamerunissa, raportoimme, että virussuppressio oli 79,4 % ja merkittäviä eroja ikäryhmien välillä: 81,1 % aikuisilla, 75,6 % lapsilla ja vain 53,3 % 10–19-vuotiailla nuorilla (7). Samoin kuin UNAIDS-raportit, HIV-tartunnan saaneet nuoret (ADLHIV) edustavat haavoittuvinta ja heikointa väestöä epidemioiden vuoksi (1, 5). Turvallisempaa kasvua kohti aikuisuutta varten on tarpeen priorisoida tämä väestö innovatiivisten hoitostrategioiden etsimiseksi, jotka varmistavat heidän hyvinvoinnin ja panoksensa SSA:n kehittämiseen.

ART:n kiistattomista eduista huolimatta nykyisillä hoitostrategioilla on rajoituksia. On huomattava, että nykyisen ART:n elinikäinen luonne liittyy useimpien potilaiden sitoutumiseen liittyviin haasteisiin, ART:n aiheuttamat toksisuudet ja jatkuva immuunijärjestelmän toimintahäiriö aiheuttavat merkittäviä terveyshaittoja, ja HIV-lääkeresistenssi (HIVDR) lisääntyy, lähinnä SSA-maissa, joissa eniten ART-hoitoa on kokenut. potilaat elävät (8). Uhka on ilmaantuva uusi HIV-epidemia, jonka HIVDR ajaa olemassa olevaan antiretroviraaliseen lääkkeeseen. Nämä haasteet pätevät erityisesti lapsiväestölle rajallisten ART-vaihtoehtojen, huonojen lääkeformulaatioiden ja lisääntyvien hoitoon sitoutumattomien tapahtumien vuoksi, kun lapset kasvavat kohti murrosikää. Nämä haasteet vaativat lähestymistapoja HIV:n (toiminnalliseen) parantamiseen tai lieventämiseen, erityisesti kaikkein haavoittuvimmille väestöryhmille (esim. ADLHIV) (7, 9).

Projektin taustalla olevat konseptit, mukaan lukien ideat ja mallit tai oletukset HIV-1:n remissio- tai hävittämisstrategioilla pyritään saavuttamaan viruksen remissio ilman antiretroviraalista hoitoa (ART). HIV-1-hoidon kehittäminen on edelleen haasteellista piilevien säiliöiden vuoksi. HIV-1:n piilevä säiliö (LR) voidaan määritellä niiden solujen osaksi, jotka sisältävät transkriptionaalisesti hiljaisen proviraalisen DNA:n ja jotka kykenevät tuottamaan tarttuvia virioneja aktivoinnin jälkeen (10). Lepomuistin CD4T-solut ovat LR:n ensisijainen isäntä, mutta HIV-1-infektio näissä soluissa on tehotonta niiden alhaisen rinnakkaisreseptoriekspression ja käänteistranskription rajoitusten vuoksi (11, 12). Siitä huolimatta on näyttöä siitä, että HIV-1 voi infektoida lepääviä CD4T-soluja suoraan tai solusta soluun siirtymisen kautta, vaikka infektio näissä soluissa liittyy hitaampaan replikaatiokinetiikkaan (13). Vaihtoehtoisesti latenssi määritetään, kun osa infektoituneita, aktivoituja CD4T-soluja palaa lepomuistifenotyyppiin, hiljentäen tehokkaasti virusgeenin ilmentymisen ja ylläpitäen samalla proviraalista DNA:ta pitkällä aikavälillä (14). Provirus pysyy lepotilassa näissä soluissa isäntätekijöiden, kuten epigeneettisen suppression, transkriptiotekijöiden, kuten NF-KB:n, ehtymisen ja ekspressoituihin geeneihin integroitumisesta johtuvan transkription häiriön kautta, joita tarkastellaan yksityiskohtaisemmin (15). Viruksen toipuminen LR:stä ART:n lopettamisen jälkeen on nopeaa, mikä johtaa havaittavaan viremiaan viikkojen kuluessa hoidon keskeyttämisestä (16). Lisäksi ART:n aloittaminen varhaisessa infektiossa ei riitä pysäyttämään LR:n muodostumista, mikä viittaa siihen, että LR muodostuu ja leviää varhaisessa vaiheessa (Chun et al., 1998; Whitney ym., 2014; Colby et al., 2018), jopa vertikaalisesti infektoituneilla lapsilla, jotka aloittivat ART pian syntymän jälkeen (17). Piilevä säiliö on stabiili vuosia kestäneestä suppressiivisesta ART:sta huolimatta ja se on hoidon keskeytymisen jälkeisen rebound-viremian lähde. Piilevästi infektoituneet solut muodostavat siksi pääasiallisen esteen HIV-1:n parantumiselle, ja ne tulisi erityisesti kohdentaa uusilla hoito- ja hävittämisstrategioilla.

LR:n läsnäolo on merkittävästi haitannut edistymistä kohti toiminnallisen tai steriloivan lääkkeen kehittämistä HIV-1:lle. Tällä hetkellä kaksi ihmistä on parantunut HIV-1-infektiosta, niin kutsutut Berliinin ja Lontoon potilaat, jotka ovat saaneet allogeenisiä kantasolusiirtoja CCR5?32/A32-luovuttajilta ja ovat jatkuvasti olleet negatiivisia virusreboundin suhteen yli 10 ja 2 vuotta ilman ART:ta (18). Näissä tapauksissa infektoitunut solupooli ehtyi merkittävästi ennen transplantaatiota ja korvattiin luovuttajasoluilla, jotka ovat vastustuskykyisiä R5-trooppisen viruksen infektiolle johtuen suuresta deleetiosta CCR5-koreseptorissa (19). CCR5 A32/32-luovuttajien suhteellisen vähäisyyden ja nämä tapaukset ennalta määräävien ainutlaatuisten olosuhteiden vuoksi tämän tyyppinen hoito ei ole mahdollista laajalle levinneelle käyttöön, mutta se korostaa kuitenkin HIV-1-hoidon perusperiaatetta; vaientaa tai hävittää HIV-1 LR (20). Viimeisen vuosikymmenen aikana ymmärrys siitä, missä ja miten HIV säilyy ART-potilaissa, on muuttunut merkittävästi todisteiden perusteella, että virus säilyy useissa solutyypeissä ja kudospaikoissa sekä sekä lepotilassa että lisääntyvissä pitkäikäisissä latentti-infektoituneissa soluissa. Siten estävän hoidon yhteydessä tarkat arviot virusvarannosta auttaisivat hallitsemaan paremmin viruksen pysyvyyttä, mikä puolestaan ​​voisi voittaa olemassa olevat esteet parantumisen saavuttamiselle (21).

Kokonais-HIV-DNA on referenssibiomarkkeri, joka sisältää sekä integroituneen että integroimattoman HIV-DNA:n ja heijastaa virusvaraston maailmanlaajuista tasoa. Tärkeää on, että Buzon et ai. raportoi tilastollisen korrelaation HIV-tartunnasta hoidon aloittamiseen kuluvan ajan ja HIV:n kokonais-DNA-tason välillä 10 vuoden jatkuvan hoidon jälkeen ryhmässä aikuisia, jotka saivat ensin varhaisen infektion (22). Lapsilla HIV-DNA-taso oli huomattavasti alhaisempi, kun viruskontrolli saavutettiin ennen 1 vuoden ikää (23). Verrattuna muihin markkereihin HIV:n kokonais-DNA:n etuna on helppo kvantifiointi standardoidulla, herkällä, reaaliaikaisella PCR:llä, mukaan lukien digitaalinen pisara-PCR (ddPCR) (24).

Yleistynyt immuuniaktivaatio on HIV-1-infektion tunnusmerkki. Tässä tilassa useat immuunisolut osoittavat lisääntynyttä aktivaation, proliferaation ja apoptoottisten markkerien ilmentymistä, solujen vaihtuvuutta ja poikkeavaa solusyklin säätelyä, proinflammatoristen sytokiinien tuotantoa ja lisääntynyttä imukudosfibroosia (25). Immuuniaktivaatio liittyy vahvasti HIV-1-taudin etenemiseen; esimerkiksi T-soluaktivaatio, mitattuna CD38:n ja HLA-DR:n ekspressiolla, ennustaa paremmin CD4+T-solujen ehtymistä ja lyhyempää eloonjäämistä kuin plasman viruskuorma (26, 27). Lisäksi immuuniaktivaation taso HIV-1-infektion varhaisessa vaiheessa CD8+T-soluaktivaatiolla mitattuna ennustaa CD4+T-solujen häviämisen plasman HIV-1-RNA-tasoista riippumatta (28). Viruksen replikaation tukahduttaminen tehokkaalla antiretroviraalisella hoidolla (ART) vähentää immuuniaktivaatiota, mutta edes tehokkaat ART-ohjelmat eivät pysty alentamaan immuuniaktivaation tasoa HIV-tartunnan saaneilla yksilöillä terveillä yksilöillä havaituille tasoille (25). Vaikka HIV-tartunnan saaneet lapset olisivat onnistuneesti hoidettu ART:lla, he kohtaavat eliniän kohonnutta immuuniaktivaatiota. Näin ollen on erityisen tärkeää arvioida kroonisen immuuniaktivaation ja tulehduksen mahdollisia vaikutuksia kehittyvään immuunijärjestelmään ja sairauden lopputulokseen lasten HIV-infektiossa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että immuuniaktivaatio (HLA-DR, CD38) ja uupumusmerkkiaineet (Tim-3, PD-1, Lag-3) liittyvät vahvasti säiliön kokoon ART-hoidetuilla aikuisilla, joten on odotettavissa, että viruksen minimoiminen Varhaisella ART:lla varustettu säiliö saattaa yhtä hyvin minimoida immuuniaktivaation tason ja jatkuvaan immuuniaktivaatioon liittyviä ei-AIDS-ikääntymisen sairauksia.

Länsi- ja Keski-Afrikan alueen HIV-varastojen karakterisoinnista on vain vähän näyttöä, sillä maantieteellisellä alueella on suurin vaihtelu kiertävissä HIV-1- ja HIV-2-kannoissa (29, 30). Esimerkiksi Kamerunissa, HIV-1:n zoonoottisessa episentrissä, on laajalti monimuotoinen HIV-maisema, jota ohjaa CRF02_AG-rekombinantti, mukaan lukien useimmat M-ryhmän (ala-)alatyypit, laaja valikoima URF- ja CRF-alueita sekä ryhmä N, O-, P- ja HIV-2-virukset (31-33). Siten perustason tietojen tuottaminen virusvaraston genotyyppisestä ja kvantitatiivisesta profiilista useissa HIV-kladeissa Kamerunin kaltaisessa ympäristössä auttaisi suunniteltaessa optimaalisia strategioita HIV:n parantamiseksi. Ottaen huomioon edellä mainitun teini-ikäisten vertikaalisen infektion haavoittuvuuden ja rajallisen tiedon virusvarastoista ja immuuniaktivaatiosta/tulehdusreaktiosta tässä populaatiossa, tästä kohteesta saadut todisteet täydentävät suuresti nykyisiä maailmanlaajuisia ponnisteluja. Tällaiset todisteet, jotka on tuotettu yhdessä infektioiden suuren taakan yhteydessä (34, 35), saattavat kuvata erilaisia ​​HIV:n pysyvyyden mekanismeja kaukana muualla maailmassa raportoiduista.

Alustava työ:

Käynnissä olevan EDCTP READY -tutkimuksen puitteissa olemme perustaneet 292 vertikaalisesti tartunnan saaneen nuoren (10–19-vuotiaat) kohortin, jotka saavat ART-hoitoa Kamerunissa. Tässä kohortissa raportoimme 40 %:n havaitsemattomasta viruskuormasta (<40 kopiota/ml) keskimäärin 8 vuoden ART-hoidon jälkeen, noin 20 %:n immunologisen epäonnistumisen (CD4<250 solua/mm3) ja alle 10 %:n kliinisen määrän. epäonnistuminen (esim. WHO:n vaiheet III/IV) (36). Tämä populaatio tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden ymmärtää säiliön kokoa ja luonnetta, immuunivasteen/sytokiiniprofiloinnin vaihtelua sekä viruksen alatyypin, hoitohistorian (ART-ohjelma ja kesto), sukupuolten välisiä eroja ja hoitoon sitoutumistasoa. virusvarasto.

TAVOITE:

Tämän tutkimuksen tavoitteena on karakterisoida HIV-varastoja ja niiden vaihtelua Kamerunissa antiretroviraalista hoitoa saavien vertikaalisesti infektoituneiden nuorten virologisten ja immunologisten profiilien mukaan ja siten parantaa virusvarastojen ymmärrystä ja tarjota tarkkoja ja luotettavia tietoja HIV-hoitotutkimukseen.

Erityistavoitteet:

Tässä tutkimuksessa me: 1. Määritämme HIV-1:n geneettisen vaihtelun ja lääkeresistenssin soluvarastoissa; 2- Kuvaile immuuniaktivaatiota/tulehdusta teini-ikäisillä, jotka ovat HIV-1-tartunnan saaneet; 3 - Arvioi HIV-säiliön koko; 4- Arvioi antiretroviraalisen hoidon ja immuunivasteen vaikutus virusvarastoprofiiliin.

Materiaalit ja menetelmät Tutkimuksen suunnittelu Suunnittelemme suorittavamme havainnoivan ja vertailevan tutkimuksen Kamerunissa HIV-tartunnan saaneiden ja ART-hoitoa saavien nuorten keskuudessa. Osallistujat valitaan ja rekisteröidään olemassa olevasta lähes 300 vertikaalisen tartunnan saaneen nuoren kohortista, jotka on värvätty EDCTP-READY-tutkimukseen.

EDCTP-READY-tutkimuksen päätavoitteena oli arvioida hoitovastetta, lääkeresistenssiä ja HIV-1-vaihtelua Kamerunissa ensimmäisen ja toisen linjan antiretroviraalista hoitoa saavien nuorten keskuudessa (7). Tässä tutkimuksessa rekrytoimme 296 HIV+-nuoria ja vertailimme HIV-1-genotyyppiprofiilia kiertävässä RNA:ssa. 30 %:sta (89/296) APHI kokee virologisen epäonnistumisen (VL> 1000 kopiota/ml).

Näytteenottomenetelmä:

EDCTP-READY-tutkimukseen osallistuneilta otetaan verinäytteitä kelpoisuuskriteerien mukaisesti.

Kelpoisuusehdot:

Osallistumiskriteerit: Otetaan mukaan tutkimukseen, 10-19-vuotiaat, vertikaalisesti infektoituneet HIV+-nuoret, jotka ovat olleet ART-hoidossa vähintään 12 kuukautta, jotka antavat kirjallisen suostumuksensa ja joiden laillinen huoltaja antaa kirjallisen valtakirjan.

Ei-kriteerit: Ei oteta huomioon, HIV+-nuori, jolla on epätäydellinen ART-historia, HBV/HCV- ja malaria-yhteisinfektiot.

Poissulkemiskriteerit: Tutkimuksesta poissuljetuksi katsotaan jokainen osallistuja, joka päättää vapaasti vetäytyä suostumuksensa jälkeen tai ei pysty antamaan verinäytettä.

Otoskoko: Tutkimuksen vähimmäisotoskoko (N) on 90 osallistujaa, laskettuna seuraavan kaavan perusteella: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02 (1-0,02) (1,962/0,052) = 30 per käsi (käsivarsi-A: VL < 40 kopiota/ml; käsi-B: VL 40-999 kopiota/ml; käsi-C: viruskuorma ≥ 1000 kopiota/ml). P on HIV-tartunnan saaneiden nuorten esiintyvyys Kamerunissa, P = 2 % [3]; α ollessa riski on yhtäpitävä α = 5 %:n kanssa; Zα on pieni rako, jossa Zα = 1,96.

HUOM: 30 HIV-negatiivisen nuoren ryhmä toimii kontrollina immunologisessa profiloinnissa.

Kaikille osallistujille annetaan uusi tunnusnumero ja tiedot keskitetään salasanalla suojattuun tietokoneeseen Kansainvälisessä Chantal Biyan (CIRCB) tutkimuskeskuksessa HIV/aidsin ehkäisyä ja hallintaa varten.

Tutkimusmenettelyt ja muuttujat Menettelyt ja aikataulut Tämän tutkimuksen suorittaminen vaatii 18 kuukautta: 3 kuukautta (kuukausi 1-3) hallinnon ja eettisen hyväksynnän, 12 kuukautta (kuukausi 4-15) osallistujien ilmoittautumiseen, näytteenottoon ja laboratorioanalyysiin, 3 kuukautta (kuukausi 16-18) tietojen käsittelyyn ja raportointiin, katso lisätietoja Gantt-kaaviosta.

EDCTP-READY-tutkimuksesta valitaan mukaanottokriteerien perusteella HIV+-nuorten tapausraporttilomakkeet ja heidän lailliseen huoltajaansa otetaan yhteyttä. Suostumus ja valtakirjalla ilmoitettu suostumus hankitaan nuorilta ja laillinen huoltaja, vastaavasti. Sosiodemografiset, kliiniset tiedot ja ART-historia arvioidaan uudelleen EDCTP-READY-tutkimukseen ilmoittautumisen aikana. Sitten 90 tai enemmän HIV+-nuoria otetaan mukaan [30 per käsi (käsi-A: VL<40 kopiota/ml; käsi-B: VL 40-999 kopiota/ml; haara-C: viruskuorma ≥1000 kopiota/ml)]. . Mukaan otetaan 30 HIV-negatiivisen nuoren ryhmä, joka toimii kontrollina immunologisessa profiloinnissa. Koulutettu flebotomisti kerää suonensisäistä verta (5 ml x 2) laboratorioanalyysiä varten, mukaan lukien PBMC:n eristäminen, plasman ja buffy coatin eristäminen, CD4/CD8-määrät, plasman viruskuorma (PVL), immuuniaktivaatio-/tulehdusmerkkiaineiden arviointi, HIV-RNA ja HIV-DNA-genotyypitys, virusvarastojen kvantifiointi.

HIV-negatiiviset osallistujat rekrytoidaan CIRCB:hen, joka on ollut HIV-tartunnan saaneiden henkilöiden hallinnan referenssikeskus vuodesta 2006 lähtien, ja sellaisena se on tunnettu HIV-testauksen referenssikeskus. Tämän edun perusteella CIRCB järjestää ilmaisia ​​HIV/HBV/HCV-seulontatestejä useille laitoksille ja yhteisöille vuodessa, joten samanlainen ilmainen testauskampanja järjestetään läheisessä lukiossa ja tämä tutkimus esitellään osallistumiskriteerit täyttäville. . Mahdolliset osallistujat kutsutaan CIRCB:hen laillisen huoltajansa kanssa ilmoittautumista varten.

Näytteitä kerätään vain kerran ilmoittautumisen yhteydessä sekä kaikki asiaankuuluvat sosio-demografiset ja kliiniset tiedot. Näytteet kuljetetaan CIRCB:hen samana päivänä PBMC:iden eristämiseksi, DNA:n, plasman ja buffy coatin eristämiseksi, CD4/CD8-laskennan ja aktivaatio-/tulehdusmerkkiaineiden arvioimiseksi virtaussytometriaa käyttäen. Plasma kerätään ja säilytetään -80 oC:ssa plasman viruskuormitusta (PVL), genotyypitystä, immuuniaktivaation/tulehdusmerkkiaineiden arviointia varten ELISA-testeillä (tai virtaussytometrialla). HIV-DNA uutetaan myöhemmin PBMC:istä ja säilytetään -80 oC:ssa; HIV-DNA toimitetaan kolmen kuukauden välein kokeellisen lääketieteen osastolle, Rooman yliopiston Tor Vergata, Rooma, Italia, HIV-virusvaraston kvantifiointia varten (katso yhteistyökirje liitteen osiossa).

Laboratoriotoimenpiteet CD4/CD8-määrä: CD4/CD8-mittaukset määritetään käyttämällä virtaussytometrialaitetta, kuten aiemmin on kuvattu (37).

Plasman viruskuorma: Plasman viruskuorma määritetään käyttämällä m 2000rt Abbottin reaaliaikaista järjestelmää, kuten aiemmin on kuvattu (38).

HIV-RNA:n erottaminen: ARN uutetaan plasmanäytteistä käyttämällä Qiamp virus RNA Mini Kit -sarjaa (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Pro-virus-DNA:n erottaminen buffy coatista: Pro-virus-DNA uutetaan käyttämällä DNeasy-veri- ja kudosuuttopakkausta (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

PBMC-solujen eristäminen: PBMC:t eristetään tiheysgradienttisentrifugoinnilla käyttäen Ficollia käyttäen talon sisäistä protokollaa.

HIV-DNA:n erottaminen PBMC-soluista: HIV-DNA uutetaan käyttämällä QIAmp DNA Mini Kitiä (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

HIV-1-geenien monistus ja sekvensointi: Sanger-sekvensointi HIV-1-lääkeresistenssitestausta varten suoritetaan nuorille, jotka kärsivät virologisesta epäonnistumisesta talon sisäisen protokollan mukaisesti, kuten tutkimusryhmämme on aiemmin kuvannut(39). Käänteistranskriptaasi-DNA-sekvensseistä analysoidaan lääkeresistenssimutaatiot käyttämällä Stanfordin yliopiston tietokannan genotyyppiresistenssitulkinta-algoritmia (www.stanford.edu).

Fylogeneettinen analyysi: Neighbor Joining -fylogeneettiset puut luodaan MEGA-ohjelmistolla (Kimura 2-parametrinen malli, 200 bootstrap-replikaatiota) ja FigTree (40, 41).

Immuuniprofilointi: Molemmat immuuniaktivaatio-/tulehdussytokiinit (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 ja TNF-alfa) arvioidaan käyttämällä kaupallisia ELISA-pakkauksia ja virtaussytometriaa.

HIV-virusvarastojen kvantifiointi: virusvarastot määritetään käyttämällä pisara-digitaalista PCR:ää (ddPCR), kuten aiemmin on kuvattu. Huomaa, että tämä kvantifiointi suoritetaan kokeellisen lääketieteen osastolla, Rooman yliopiston Tor Vergata, Rooma, Italia, kuten tämän ehdotuksen liitteenä olevassa yhteistyökirjeessä todetaan. CIRCB:n ja UTV:n välillä allekirjoitetaan materiaalin siirto ja tiedonjakosopimus ennen näytelähetystä UTV:lle. Se on talon sisäinen protokolla HIV-1 B -alatyypeille, ja sitä mukautetaan kamerunilaisista näytteistä odotettavissa oleville HIV-1 ei-B-alatyypeille.

Tietojen analysointi Tutkimuksen aikana kerätyt tiedot analysoidaan SPSS-ohjelmistolla. Assosioituneet tekijät arvioidaan käyttämällä monimuuttujalogistista regressiota ja estimaattista lähestymistapaa eri parametrien puolueettomalle vaikutukselle. Tiedot raportoidaan mediaanina. Ei-parametrisia testejä käytetään tiedoille, jotka eivät jakaannu normaalisti, ja mediaanien vertailut eri ryhmien välillä (virologinen menestys vs. virologinen epäonnistuminen) suoritetaan U-Mann-Whitney-testillä. Korrelaatiot tehdään Spearman-testillä ja p-arvoja, jotka ovat pienempiä kuin 0,05, pidetään tilastollisesti merkitsevinä.

Eettiset näkökohdat Tämä tutkimus tehdään Helsingin julistuksen ihmisiin kohdistuvan lääketieteellisen tutkimuksen eettisistä periaatteista mukaisesti. Eettinen hyväksyntä saadaan Kamerunin kansalliselta eettiseltä komitealta ihmisten terveyden tutkimusta varten. tutkimuksesta tehdyn tietoisen ilmoituksen jälkeen hankitaan laillisen huoltajan kirjallinen valtakirja, ja myös osallistuvalta HIV+-nuorelta hankitaan kirjallinen suostumus ilman mitään pakkoa. Yksityisyys ja luottamuksellisuus varmistetaan käyttämällä yksilöllisiä tunnisteita ja salasanalla suojattua tietokantaa, ja niihin pääsee vain valtuutettu henkilökunta. Osallistujat voivat halutessaan poistua tutkimuksesta milloin tahansa ilman, että he vaikuttavat heidän rutiinivalvontaansa tutkimusklinikalla. Flebotomia on ei-invasiivinen (laskimopunktio), ja sen suorittaa koulutettu sairaanhoitaja.

Laatuvakuutus:

Tutkimustiimiimme kuuluu laadunvarmistusvastaava, joka vastaa kaikista tutkimusprotokollan SOP-toimista ja hoitaa pätevyyden testaamista ja tietojen validointia koko tutkimuksen ajan.

Mahdollisten riskien hallinta: Potilaille aiheutuvat riskit ovat minimaaliset, koska ainoa toimenpide, jolle vapaaehtoinen joutuu, on flebotomistin tai lääkärin suorittama laskimopunktio. Suonenpunktio voi olla hieman kipeä, mutta käytännössä ilman komplikaatioriskiä. Potentiaaliset riskit koehenkilöille, joista mikään ei ole todennäköistä, voivat sisältää hetkellistä kipua, mustelmia paikalla tai mahdollinen (mutta erittäin epätodennäköinen) infektio. Jos tällaisia ​​komplikaatioita ilmenee, osallistujalle tarjotaan ensiapua.