Caracterización de los reservorios de VIH-1 en adolescentes infectados por VIH-1 no B que reciben TAR en Camerún (AVIR)

Título: Caracterización de reservorios virales entre adolescentes con infección vertical por VIH-1 no B que reciben terapia antirretroviral en Camerún.

Acrónimo: estudio AVIR, reservorio viral adolescente

Importancia y relevancia El África subsahariana (ASS) se ve afectada desproporcionadamente por el VIH/SIDA, con cerca del 70% de las epidemias mundiales. Con la mayor carga de infecciones pediátricas por VIH, alrededor de nueve de cada 10 niños que viven con el VIH se encuentran en la región ASS(1, 2). Los adolescentes y jóvenes representan una proporción cada vez mayor de personas que viven con el VIH en todo el mundo. En 2019, alrededor de 1,7 millones [1,1 millones-2,4 Millones de adolescentes de entre 10 y 19 años vivían con el VIH en todo el mundo, lo que representa aproximadamente el 5% de todas las personas que viven con el VIH; alrededor de 1,5 millones [1,0 - 2,1 millones] o el 88% de los adolescentes infectados por el VIH viven en África subsahariana. Solo en 2019, 460.000 [260.000-680.000] jóvenes de entre 10 y 24 años se infectaron por primera vez con el VIH, de los cuales 170.000 [53.000-340.000] eran adolescentes de entre 10 y 19 años. Para agravar esta situación, los datos más recientes indican que sólo el 27% de las adolescentes y el 16% de los adolescentes varones de entre 15 y 19 años en África oriental y meridional -la región más afectada por el VIH- se han sometido a la prueba del VIH en los últimos 12 meses y han recibido el resultado de la última prueba. Las tasas de pruebas en África occidental y central y en Asia meridional son aún más bajas. Si las tendencias actuales continúan, cientos de miles más se volverán VIH positivos en los próximos años y, sin conocer su estado, los adolescentes se perderán un tratamiento que les salvará la vida. Además, una gran población de niños infectados con el VIH de forma perinatal durante la última década está llegando a la adolescencia (3). De las 690.000 personas estimadas que murieron por enfermedades relacionadas con el sida en 2019, 110.000 (o aproximadamente el 16%) eran niños menores de 20 años. (Tendencias globales y regionales de UNICEF, julio de 2020).

Con la llegada y la escalabilidad de la terapia antirretroviral (TAR), hay una disminución global de las muertes relacionadas con el SIDA. A finales de 2019, 25,4 millones de personas accedían a la terapia antirretroviral, lo que representa el 67% de todas las personas que viven con el VIH. Sin embargo, sólo el 53% de los niños que viven con el VIH recibían TAR. Curiosamente, alrededor del 94% de todos los niños que reciben TAR son del África subsahariana (4). En este contexto de continuas nuevas infecciones pediátricas por VIH y de creciente cobertura del TAR pediátrico, aumentará el número de niños que viven con el VIH, lo que sugiere una mayor probabilidad de llegar a la adolescencia e incluso a la edad adulta si los regímenes de tratamiento siguen siendo plenamente eficaces para controlar la infección por el VIH (3, 4). Por lo tanto, ADLHIV constituye una población de VIH con crecientes preocupaciones de salud y con hallazgos muy limitados para las mejores prácticas generalizables específicas para esta población objetivo, especialmente en ASS.

Al igual que varios países de África occidental y central, Camerún todavía se enfrenta a una epidemiología generalizada del VIH (prevalencia del 2,7%) (5), con mayor prevalencia entre las mujeres embarazadas (5,7%) y los lactantes y niños expuestos al VIH (5,8% [958/16.638 ] positividad en la primera PCR y 15% al ​​final de la cascada de PTMI) (6). A junio de 2018, la cobertura nacional de TAR era del 51,5% (281.083), lo que incluye a 12.362 niños menores de 15 años (6). En cuanto a la respuesta al TAR en Camerún, informamos una tasa general de supresión viral del 79,4 %, con disparidades significativas entre los rangos de edad: 81,1 % en adultos, 75,6 % en niños y solo 53,3 % en adolescentes de 10 a 19 años (7). Al igual que en los informes de ONUSIDA, los adolescentes que viven con el VIH (ADLVIH) representan la población más vulnerable y desatendida en respuesta a las epidemias(1, 5). Para un crecimiento más seguro hacia la edad adulta, es necesario priorizar a esta población para la búsqueda de estrategias de tratamiento innovadoras que aseguren su bienestar y su contribución para el desarrollo del ASS.

A pesar de los beneficios incuestionables del TAR, existen limitaciones en las estrategias de tratamiento actuales. Es de destacar que el carácter de por vida del actual TAR conlleva desafíos relacionados con el cumplimiento del TAR para la mayoría de los pacientes, las toxicidades atribuidas al TAR y la disfunción inmune persistente tienen importantes problemas de salud, y la resistencia a los medicamentos contra el VIH (VIDR) está aumentando, sobre todo en los países del África subsahariana donde la mayoría de los que tienen experiencia con el TAR viven los pacientes (8). Existe la amenaza de que surja una nueva epidemia de VIH, impulsada por la FRVIH a los antirretrovirales existentes. Estos desafíos son particularmente ciertos para las poblaciones pediátricas debido a las opciones limitadas de TAR, las formulaciones deficientes de los medicamentos y el aumento de los casos de incumplimiento a medida que avanzan hacia la adolescencia. Estos desafíos exigen enfoques hacia la cura o remisión (funcional) del VIH, especialmente para las poblaciones más vulnerables (es decir, ADVIH) (7, 9).

Los conceptos que sustentan el proyecto, incluidas ideas, modelos o suposiciones, las estrategias de remisión o erradicación del VIH-1 tienen como objetivo lograr la remisión viral en ausencia de terapia antirretroviral (TAR). El desarrollo de una cura para el VIH-1 sigue siendo un desafío debido a los reservorios latentes. El reservorio latente (LR) del VIH-1 se puede definir como la fracción de células que albergan ADN proviral transcripcionalmente silencioso y que son capaces de producir viriones infecciosos después de la activación(10). Las células CD4T con memoria en reposo son el huésped principal de LR, pero la infección por VIH-1 en estas células es ineficiente debido a su baja expresión de correceptores y restricciones inherentes a la transcripción inversa (11, 12). Sin embargo, existe evidencia de que el VIH-1 puede infectar células CD4T en reposo directamente o mediante transmisión de célula a célula, aunque la infección en estas células se asocia con una cinética de replicación más lenta (13). Alternativamente, la latencia se establece cuando un subconjunto de células CD4T activadas infectadas revierten a un fenotipo de memoria en reposo, silenciando efectivamente la expresión del gen viral mientras se mantiene el ADN proviral a largo plazo (14). El provirus se mantiene en un estado inactivo en estas células a través de factores del huésped como la supresión epigenética, el agotamiento de factores de transcripción como NF-κB y la interferencia transcripcional debido a la integración en genes expresados, revisados ​​con más detalle (15). El rebote viral del LR después de la interrupción del TAR es rápido, lo que lleva a una viremia detectable a las pocas semanas de la interrupción del tratamiento (16). Además, iniciar el TAR en una etapa temprana de la infección no es suficiente para detener la formación de LR, lo que sugiere que el LR se establece y se disemina temprano (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), incluso en niños infectados verticalmente que comenzaron el TAR poco después del nacimiento (17). El reservorio latente es estable a pesar de años de TAR supresor y es la fuente de viremia de rebote después de la interrupción del tratamiento. Por lo tanto, las células con infección latente representan la principal barrera para una cura del VIH-1 y deberían ser objeto específicamente de nuevos tratamientos y estrategias de erradicación.

El progreso hacia el desarrollo de una cura funcional o esterilizante para el VIH-1 se ha visto significativamente obstaculizado por la presencia del LR. Actualmente, dos personas se han curado de la infección por VIH-1, los llamados pacientes de Berlín y Londres, que desde que recibieron trasplantes alogénicos de células madre de donantes CCR5?32/?32, han dado negativo sistemáticamente en pruebas de rebote viral durante más de 10 y 2 años, respectivamente, sin TAR (18). En estos casos, el conjunto de células infectadas se agotó significativamente durante el acondicionamiento previo al trasplante y se reemplazó con células del donante que son resistentes a la infección con el virus con tropismo R5 debido a una gran deleción en el correceptor CCR5 (19). Debido a la relativa escasez de donantes de CCR5 ?32/?32 y las circunstancias únicas que predeterminan estos casos, este tipo de cura no es factible para un uso generalizado; sin embargo, enfatiza el principio básico de la cura del VIH-1; silenciar o erradicar el VIH-1 LR (20). Durante la última década, la comprensión de dónde y cómo persiste el VIH en personas que reciben TAR se ha transformado sustancialmente con evidencia de que el virus persiste en múltiples tipos de células y sitios de tejido, y en células infectadas de larga vida latentes, tanto quiescentes como proliferantes. Así, en el marco de un tratamiento supresor, estimaciones precisas del reservorio viral ayudarían a controlar mejor la persistencia viral, lo que a su vez podría superar las barreras existentes para lograr una cura(21).

El ADN total del VIH es un biomarcador de referencia que incluye ADN del VIH integrado y no integrado y refleja el nivel global del reservorio viral. Es importante destacar que Buzón et al. informaron una correlación estadística entre el tiempo transcurrido desde la infección por VIH hasta el inicio del tratamiento y el nivel total de ADN del VIH después de 10 años de tratamiento continuo en una cohorte de adultos tratados por primera vez con infección temprana (22). En los niños, el nivel de ADN del VIH era notablemente más bajo cuando se lograba el control viral antes del año de edad (23). En comparación con otros marcadores, el ADN total del VIH tiene la ventaja de una fácil cuantificación mediante PCR estandarizada, sensible y en tiempo real, incluida la PCR digital en gotas (ddPCR) (24).

La activación inmune generalizada es un sello distintivo de la infección por VIH-1. En este estado, una variedad de células inmunes muestran un aumento en la expresión de activación, proliferación y marcadores apoptóticos, recambio celular con regulación aberrante del ciclo celular, producción de citocinas proinflamatorias y aumento de la fibrosis del tejido linfoide (25). La activación inmune está fuertemente asociada con la progresión de la enfermedad por VIH-1; por ejemplo, la activación de las células T, medida por la expresión de CD38 y HLA-DR, predice más el agotamiento de las células T CD4+ y una supervivencia más corta que la carga viral plasmática (26, 27). Además, el nivel de activación inmunitaria temprana en la infección por VIH-1, medido por la activación de las células T CD8+, predice la pérdida de células T CD4+ independientemente de los niveles plasmáticos de ARN del VIH-1 (28). La supresión de la replicación viral con un tratamiento antirretroviral (TAR) eficaz reduce la activación inmunitaria, pero ni siquiera los regímenes de TAR eficaces pueden reducir los niveles de activación inmunitaria en personas infectadas por el VIH a los niveles observados en personas sanas (25). Los niños infectados por el VIH, incluso si reciben tratamiento antirretroviral con éxito, se enfrentan a una vida de activación inmunitaria elevada. Por lo tanto, es de particular importancia evaluar el impacto potencial de la activación inmune crónica y la inflamación en el sistema inmunológico en desarrollo y en el resultado de la enfermedad en la infección por VIH pediátrica. Estudios recientes demostraron que la activación inmune (HLA-DR, CD38) y los marcadores de agotamiento (Tim-3, PD-1, Lag-3) están fuertemente asociados con el tamaño del reservorio en adultos tratados con TAR, por lo que se podría anticipar que minimizar la infección viral El reservorio con TAR temprano podría, igualmente, minimizar el nivel de activación inmune y las enfermedades de "envejecimiento" no relacionadas con el SIDA asociadas con una activación inmune persistente.

Hay pruebas limitadas para caracterizar los reservorios del VIH en la región de África occidental y central, un entorno geográfico que tiene una mayor variabilidad en las cepas circulantes de VIH-1 y VIH-2 (29, 30). Por ejemplo, Camerún, epicentro zoonótico del VIH-1, alberga un panorama muy diverso de VIH impulsado por el recombinante CRF02_AG, que incluye la mayoría de los (sub)subtipos del grupo M, una amplia gama de URF y CRF, y el grupo N, Virus O, P y VIH-2(31-33). Por lo tanto, generar datos de referencia sobre el perfil genotípico y cuantitativo del reservorio viral en varios clados del VIH en un entorno como Camerún ayudaría a diseñar estrategias óptimas para la cura del VIH. Teniendo en cuenta la vulnerabilidad antes mencionada de los adolescentes con infección vertical y el conocimiento limitado sobre los reservorios virales y la activación inmune/reacción inflamatoria en esta población, la evidencia generada a partir de este objetivo será altamente complementaria a los esfuerzos globales actuales. Esta evidencia, generada en un contexto de alta carga de coinfecciones (34, 35), podría representar mecanismos diferenciales de persistencia del VIH muy alejados de los reportados en otras partes del mundo.

Trabajo preliminar:

En el marco del estudio EDCTP READY en curso, hemos creado una cohorte de 292 adolescentes (10-19 años) infectados verticalmente que reciben TAR en Camerún. En esta cohorte, informamos una tasa del 40 % de carga viral indetectable (<40 copias/mL) después de una mediana de 8 años de TAR, alrededor del 20 % de tasa de falla inmunológica (CD4 <250 células/mm3) y menos del 10 % de tasa clínica. fracaso (es decir, Estadios III/IV de la OMS) (36). Esta población ofrece una oportunidad única para comprender el tamaño y la naturaleza del reservorio, la variabilidad de la respuesta inmune/perfil de citocinas y el efecto del subtipo viral, el historial de tratamiento (régimen y duración del TAR), las disparidades de género y el nivel de adherencia en el control de reservorio viral.

APUNTAR:

El objetivo de este estudio es caracterizar los reservorios del VIH y su variabilidad según los perfiles virológicos e inmunológicos de adolescentes infectados verticalmente que reciben terapia antirretroviral en Camerún y, por lo tanto, mejorar la comprensión de los reservorios virales y proporcionar datos precisos y confiables para la investigación de la cura del VIH.

Objetivos específicos:

En este estudio, vamos a: 1- Determinar la variabilidad genética del VIH-1 y la resistencia a los medicamentos en reservorios celulares; 2- Caracterizar la activación/inflamación inmune en adolescentes infectados verticalmente con VIH-1; 3- Evaluar el tamaño del reservorio del VIH; 4- Evaluar el efecto de la terapia antirretroviral y la respuesta inmune sobre el perfil del reservorio viral.

Materiales y métodos Diseño del estudio Planeamos realizar un estudio observacional y comparativo entre adolescentes que viven con VIH y reciben TAR en Camerún. Los participantes serán seleccionados e inscritos de una cohorte existente de cerca de 300 adolescentes infectados verticalmente reclutados para el estudio EDCTP-READY.

El objetivo principal del estudio EDCTP-READY fue evaluar la respuesta al tratamiento, la resistencia a los medicamentos y la variabilidad del VIH-1 entre adolescentes que reciben terapia antirretroviral de primera y segunda línea en Camerún (7). En este estudio, reclutamos a 296 adolescentes VIH+ y comparamos el perfil genotípico del VIH-1 en el ARN circulante. Del 30% (89/296) APHI experimentó fracaso virológico (VL>1000 copias/mL).

Método de muestreo:

Se recolectarán muestras de sangre de los participantes del estudio EDCTP-READY de acuerdo con los criterios de elegibilidad.

Criterio de elegibilidad:

Criterios de inclusión: Se inscribirán en el estudio adolescentes VIH+ de 10 a 19 años, infectados verticalmente, que hayan recibido TAR durante al menos 12 meses, que proporcionen su consentimiento por escrito y cuyo tutor legal proporcione su consentimiento por escrito.

Criterios de no inclusión: No se considerarán para la inscripción, adolescentes VIH+ con antecedentes de TAR incompletos, coinfecciones por VHB/VHC y malaria.

Criterios de exclusión: Se considerará excluido del estudio cualquier participante que decida libremente retirarse después de haber dado su consentimiento o no poder dar muestra de sangre.

Tamaño de muestra: El tamaño mínimo de muestra (N) del estudio es de 90 participantes, calculado con base en la siguiente fórmula: N=p (1-p) (Zα2/α2); norte = 0,02 (1-0,02) (1,962/0,052) = 30 por grupo (grupo A: VL <40 copias/mL; grupo B: VL 40-999 copias/mL; grupo C: carga viral ≥1000 copias/mL). P es la prevalencia de adolescentes que viven con el VIH en Camerún con P = 2% [3]; Siendo α el riesgo concuerda con α = 5%; Siendo Zα la pequeña brecha con Zα = 1,96.

NB: Un grupo de 30 adolescentes VIH negativos servirá como control para el perfil inmunológico.

A todos los participantes se les asignará un nuevo número de identificación y los datos se centralizarán en una computadora protegida con contraseña en el Centro de Referencia Internacional Chantal Biya (CIRCB) para la investigación sobre la prevención y el manejo del VIH/SIDA.

Procedimientos y variables del estudio Procedimientos y cronogramas El presente estudio requiere 18 meses para completarse: 3 meses (mes 1-3) para la administración y aprobación ética, 12 meses (mes 4 al 15) para la inscripción de participantes, muestreo y análisis de laboratorio, 3 meses (mes 16 a 18) para procesamiento de datos e informes; consulte el diagrama de Gantt para obtener más detalles.

Según los criterios de inclusión, se seleccionarán formularios de informe de casos de adolescentes VIH+ del estudio EDCTP-READY y se contactará a su tutor legal. Se obtendrá el asentimiento y el consentimiento informado por representación de los adolescentes y del tutor legal, respectivamente. Los datos sociodemográficos, clínicos y el historial de TAR se evaluarán nuevamente durante el período durante la inscripción en el estudio EDCTP-READY. Luego se inscribirán 90 o más adolescentes VIH+ [30 por grupo (grupo A: VL <40 copias/mL; grupo B: VL 40-999 copias/mL; grupo C: carga viral ≥1000 copias/mL)]. . Se inscribirá a un grupo de 30 adolescentes VIH negativos para que sirvan como control del perfil inmunológico. Un flebotomista capacitado recolectará sangre intravenosa (5 ml x 2) para análisis de laboratorio que incluyen aislamiento de PBMC, aislamiento de plasma y capa leucocitaria, recuentos de CD4/CD8, carga viral plasmática (PVL), evaluación de activación inmune/marcadores inflamatorios, ARN del VIH y Genotipado del ADN-VIH, cuantificación de reservorios virales.

Los participantes VIH negativos serán reclutados en el CIRCB, esta institución es un Centro de referencia para el manejo de personas infectadas por el VIH desde 2006, y como tal es un centro de referencia reconocido para las pruebas del VIH. Sobre la base de esta ventaja, CIRCB organiza pruebas de detección de VIH/VHB/VHC gratuitas para varias instituciones y comunidades por año, por lo tanto, se organizará una campaña de pruebas gratuitas similar en una escuela secundaria cercana y el presente estudio se presentará a aquellos que cumplan con los criterios de inclusión. . Los posibles participantes serán invitados al CIRCB con su tutor legal para su inscripción.

Las muestras se recolectarán solo una vez en el momento de la inscripción, así como todos los datos sociodemográficos y clínicos relevantes. Las muestras se transportarán a CIRCB el mismo día para el aislamiento de PBMC, aislamiento de ADN, plasma y capa leucocitaria, recuentos de CD4/CD8 y evaluación de marcadores de activación/inflamación mediante citometría de flujo. El plasma se recolectará y almacenará a -80 ° C para la carga viral plasmática (PVL), genotipado, activación inmune / evaluación de marcadores inflamatorios mediante pruebas ELISA (o citometría de flujo). Posteriormente, el ADN del VIH se extraerá de las PBMC y se almacenará a -80oC; El ADN del VIH se enviará cada tres meses al departamento de medicina experimental de la Universidad de Roma Tor Vergata, Roma (Italia), para la cuantificación del reservorio viral del VIH (consulte la carta de colaboración en la sección del anexo).

Procedimientos de laboratorio Recuento de CD4/CD8: las mediciones de CD4/CD8 se determinarán utilizando una máquina de citometría de flujo como se describió anteriormente (37).

Carga viral plasmática: la carga viral plasmática se determinará utilizando el sistema en tiempo real m 2000rt Abbott como se describió anteriormente (38).

Extracción de ARN del VIH: el ARN se extraerá de muestras de plasma utilizando el mini kit de ARN viral Qiamp (Qiagen) como lo describe el fabricante.

Extracción de ADN proviral de la capa leucocitaria: el ADN proviral se extraerá utilizando el kit de extracción de sangre y tejido DNeasy (Qiagen) como lo describe el fabricante.

Aislamiento de PBMC: las PBMC se aislarán mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll utilizando un protocolo interno.

Extracción de ADN del VIH de PBMC: el ADN del VIH se extraerá utilizando el mini kit QIAmp DNA (Qiagen) como lo describe el fabricante.

Amplificación y secuenciación de genes del VIH-1: Se realizará la secuenciación de Sanger para las pruebas de resistencia a los medicamentos del VIH-1 en adolescentes que experimenten falla virológica mediante un protocolo interno, como lo describió anteriormente nuestro grupo de investigación (39). Las secuencias de ADN de la transcriptasa inversa se analizarán en busca de mutaciones de resistencia a los medicamentos utilizando el algoritmo de interpretación de resistencia genotípica de la base de datos de la Universidad de Stanford (www.stanford.edu).

Análisis filogenético: se crearán árboles filogenéticos de unión de vecinos utilizando el software MEGA (modelo de 2 parámetros de Kimura, 200 replicaciones de arranque) y FigTree (40, 41).

Perfil inmunológico: tanto la activación inmune como las citoquinas inflamatorias (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 y TNF-alfa) se evaluarán utilizando kits ELISA comerciales y citometría de flujo.

Cuantificación de reservorios virales del VIH: los reservorios virales se cuantificarán mediante PCR digital en gotas (ddPCR) como se describió anteriormente. Es de destacar que esta cuantificación se realizará en el departamento de medicina experimental de la Universidad de Roma Tor Vergata, Roma, Italia, como se indica en la carta de colaboración que se encuentra en el anexo de esta propuesta. Se firmará un acuerdo de transferencia de material y de intercambio de datos entre CIRCB y UTV antes del envío de la muestra a UTV. Es un protocolo interno para el subtipo B del VIH-1 y se ajustará a los subtipos no B del VIH-1 que se esperan de las muestras de Camerún.

Análisis de datos Los datos recopilados durante el estudio se analizarán utilizando el software SPSS. Los factores asociados se evaluarán mediante regresión logística multivariada, con un enfoque de estimación del efecto insesgado de diferentes parámetros. Los datos se informarán como mediana. Se utilizarán pruebas no paramétricas para datos que no se distribuyen normalmente; las comparaciones de medianas entre diferentes grupos (éxito virológico frente a fracaso virológico) se realizarán mediante la prueba U-Mann-Whitney. Las correlaciones se realizarán con la prueba de Spearman y se considerarán valores de p inferiores a 0,05 estadísticamente significativos.

Consideraciones éticas Este estudio se llevará a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki sobre principios éticos para la investigación médica en seres humanos. Se obtendrá la autorización ética del Comité Nacional de Ética de Camerún para la investigación en salud humana. después de una notificación informada sobre el estudio, se obtendrá un poder informado por escrito del tutor legal, y también se obtendrá un consentimiento por escrito del adolescente VIH+ participante, sin ningún tipo de coerción. Se garantizará la privacidad y la confidencialidad mediante el uso de identificadores únicos y una base de datos protegida con contraseña y solo el personal autorizado tendrá acceso a ella. Los participantes serán libres de abandonar deliberadamente el estudio en cualquier momento, sin ningún efecto en su seguimiento de rutina en la clínica del estudio. La flebotomía no será invasiva (venopunción) y la realizará una enfermera capacitada.

Seguro de calidad:

Nuestro equipo de estudio incluirá un oficial de control de calidad que será responsable de todos los POE del protocolo del estudio y gestionará las pruebas de competencia y la validación de datos durante todo el estudio.

Manejo de riesgos potenciales: Los riesgos para los pacientes son mínimos ya que el único procedimiento al que se somete al voluntario es la punción venosa realizada por un flebotomista o médico. La punción venosa puede ser ligeramente dolorosa, pero prácticamente no presenta riesgo de complicaciones. Los riesgos potenciales para los sujetos, ninguno de los cuales es probable que ocurra, pueden incluir dolor momentáneo, hematomas en el sitio o una posible (pero extremadamente improbable) infección. Si surgen tales complicaciones, el participante recibirá tratamiento médico de emergencia.