Caracterização de reservatórios de HIV-1 em adolescentes não infectados com HIV-1 em tratamento antirretroviral em Camarões (AVIR)

Título: Caracterização de reservatórios virais entre adolescentes infectados verticalmente não-B com HIV-1 recebendo terapia antirretroviral em Camarões.

Sigla: Estudo AVIR, Reservatório viral para adolescentes

Importância e relevância A África Subsariana (ASS) é desproporcionalmente afectada pelo VIH/SIDA, com perto de 70% das epidemias globais. Com o fardo mais elevado de infecções pediátricas por VIH, cerca de nove em cada 10 crianças que vivem com VIH encontram-se na região da ASS(1, 2). Adolescentes e jovens representam uma parcela crescente de pessoas que vivem com VIH em todo o mundo. Em 2019, cerca de 1,7 milhão [1,1 milhão-2,4 milhões] de adolescentes com idades entre 10 e 19 anos viviam com o VIH em todo o mundo, representando cerca de 5% de todas as pessoas que vivem com o VIH, cerca de 1,5 milhões [1,0 - 2,1 milhões] ou 88% dos adolescentes infectados pelo VIH vivem na ASS. Só em 2019, 460.000 [260.000-680.000] jovens com idades entre os 10 e os 24 anos foram recentemente infectados pelo VIH, dos quais 170.000 [53.000-340.000] eram adolescentes com idades entre os 10 e os 19 anos. Para agravar esta situação, os dados mais recentes indicam que apenas 27% das raparigas adolescentes e 16% dos rapazes adolescentes com idades compreendidas entre os 15 e os 19 anos na África Oriental e Austral - a região mais afectada pelo VIH - foram testados para o VIH nos últimos 12 meses e receberam o resultado do último teste. As taxas de testes na África Ocidental e Central e no Sul da Ásia são ainda mais baixas. Se as tendências actuais se mantiverem, centenas de milhares de pessoas tornar-se-ão seropositivas nos próximos anos e, sem conhecer o seu estado, os adolescentes perderão o tratamento que pode salvar vidas. Além disso, uma grande população de crianças infectadas com VIH no período perinatal durante a última década está a crescer até à adolescência (3). Das cerca de 690 mil pessoas que morreram de doenças relacionadas com a SIDA em 2019, 110 mil (ou aproximadamente 16%) delas eram crianças com menos de 20 anos de idade. (Tendências globais e regionais da UNICEF, julho de 2020).

Com o advento e a escalabilidade da terapia anti-retroviral (TARV), há uma diminuição global nas mortes relacionadas com a SIDA. No final de 2019, 25,4 milhões de pessoas tinham acesso à terapia antirretroviral, representando 67% de todas as pessoas que viviam com VIH. No entanto, apenas 53% das crianças que vivem com VIH estavam a receber TARV. Curiosamente, cerca de 94% de todas as crianças que recebem TARV são da ASS (4). Neste contexto de novas infecções pediátricas contínuas por VIH e de aumento da cobertura em TAR pediátrica, o número de crianças que vivem com VIH aumentará, sugerindo uma maior probabilidade de atingir a idade adolescente e mesmo a idade adulta se os regimes de tratamento permanecerem totalmente eficazes no controlo da infecção pelo VIH (3, 4). Portanto, o ADLHIV constitui uma população seropositiva com preocupações crescentes em matéria de saúde e com resultados muito limitados para melhores práticas generalizáveis ​​específicas para esta população-alvo, especialmente na ASS.

Tal como vários países da África Ocidental e Central, os Camarões ainda enfrentam uma epidemiologia generalizada do VIH (prevalência de 2,7%) (5), com prevalência mais elevada entre mulheres grávidas (5,7%) e bebés/crianças expostas ao VIH (5,8% [958/16.638 ] positividade na primeira PCR e 15% no final da cascata da PTV) (6). Em Junho de 2018, a cobertura nacional da TARV era de 51,5% (281.083), o que inclui 12.362 crianças com menos de 15 anos de idade (6). Em relação à resposta à TARV nos Camarões, reportámos uma taxa global de 79,4% de supressão viral, com disparidades significativas entre faixas etárias: 81,1% em adultos, 75,6% em crianças e apenas 53,3% em adolescentes com idades compreendidas entre os 10 e os 19 anos (7). À semelhança dos relatórios da ONUSIDA, os adolescentes que vivem com VIH (ADLHIV) representam a população mais vulnerável e mal servida em resposta às epidemias(1, 5). Para um crescimento mais seguro rumo à idade adulta, é necessário priorizar esta população na busca de estratégias de tratamento inovadoras que garantam o seu bem-estar e a sua contribuição para o desenvolvimento da ASS.

Apesar dos benefícios inquestionáveis ​​da TARV, existem limitações nas estratégias de tratamento atuais. É digno de nota que a natureza vitalícia da TARV actual acarreta desafios relacionados com a adesão da maioria dos pacientes, as toxicidades atribuídas à TARV e a disfunção imunitária persistente têm prejuízos significativos para a saúde, e a resistência aos medicamentos para o VIH (HIVDR) está a aumentar, principalmente nos países da ASS, onde a maioria das pessoas com experiência em TARV os pacientes estão vivos (8). Existe a ameaça de uma nova epidemia emergente de VIH, impulsionada pela RDVIH aos anti-retrovirais existentes. Estes desafios são particularmente verdadeiros para as populações pediátricas devido às opções limitadas de TAR, às formulações deficientes dos medicamentos e ao aumento dos casos de não adesão à medida que avançam para a adolescência. Estes desafios exigem abordagens para a cura ou remissão (funcional) do VIH, especialmente para as populações mais vulneráveis ​​(ou seja, ADLHIV) (7, 9).

Os conceitos que sustentam o projecto, incluindo ideias e modelos ou pressupostos, as estratégias de remissão ou erradicação do VIH-1 visam alcançar a remissão viral na ausência de terapia anti-retroviral (TARV). O desenvolvimento de uma cura para o VIH-1 continua a ser um desafio devido aos reservatórios latentes. O Reservatório Latente (LR) do HIV-1 pode ser definido como a fração de células que abrigam DNA proviral transcricionalmente silencioso que são capazes de produzir vírions infecciosos após a ativação(10). As células T CD4 de memória em repouso são o hospedeiro primário do LR, mas a infecção pelo HIV-1 nestas células é ineficiente devido à sua baixa expressão de co-receptores e às restrições inerentes à transcrição reversa (11, 12). No entanto, há evidências de que o VIH-1 pode infectar células T CD4 em repouso directamente ou através da transmissão célula-a-célula, embora a infecção nestas células esteja associada a uma cinética de replicação mais lenta (13). Alternativamente, a latência é estabelecida quando um subconjunto de células T CD4 ativadas e infectadas reverte para um fenótipo de memória em repouso, silenciando efetivamente a expressão do gene viral enquanto mantém o DNA proviral a longo prazo(14). O provírus é mantido num estado quiescente nestas células através de factores do hospedeiro, tais como supressão epigenética, depleção de factores de transcrição, tais como NF-κB e interferência transcricional devido à integração em genes expressos, revistos em mais detalhe (15). A recuperação viral do RL após a interrupção da TARV é rápida, levando à viremia detectável semanas após a interrupção da terapia (16). Além disso, iniciar a TARV no início da infecção não é suficiente para interromper a formação do LR, sugerindo que o LR é estabelecido e disseminado precocemente (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), mesmo em crianças infectadas verticalmente que iniciaram TARV logo após o nascimento (17). O reservatório latente é estável apesar de anos de TARV supressiva e é a fonte de viremia rebote após a interrupção da terapia. As células latentemente infectadas representam, portanto, a principal barreira à cura do VIH-1 e devem ser especificamente visadas por novas estratégias de tratamento e erradicação.

O progresso no sentido do desenvolvimento de uma cura funcional ou esterilizante para o VIH-1 foi significativamente dificultado pela presença do LR. Atualmente, duas pessoas foram curadas da infecção pelo HIV-1, os chamados pacientes de Berlim e Londres, que desde que receberam transplantes alogênicos de células-tronco de doadores CCR5?32/?32, apresentaram resultados consistentemente negativos para recuperação viral por mais de 10 e 2 anos. anos, respectivamente, sem TARV (18). Nestes casos, o conjunto de células infectadas foi significativamente esgotado durante o condicionamento pré-transplante e substituído por células doadoras que são resistentes à infecção pelo vírus com tropismo R5 devido a uma grande deleção no co-receptor CCR5 (19). Devido à relativa escassez de doadores CCR5 ?32/?32 e às circunstâncias únicas que predeterminam estes casos, este tipo de cura não é viável para utilização generalizada, mas enfatiza o princípio básico da cura do VIH-1; silenciar ou erradicar a LR do HIV-1 (20). Ao longo da última década, a compreensão de onde e como o VIH persiste em indivíduos em TARV transformou-se substancialmente com evidências de que o vírus persiste em múltiplos tipos de células e locais de tecido, e tanto em células latentes de vida longa quiescentes como em proliferação. Assim, no âmbito de um tratamento supressivo, estimativas precisas do reservatório viral ajudariam a um melhor domínio da persistência viral, o que por sua vez poderia superar as barreiras existentes para alcançar a cura(21).

O DNA total do HIV é um biomarcador de referência que inclui DNA do HIV integrado e não integrado e reflete o nível global do reservatório viral. É importante ressaltar que Buzon et al. relataram uma correlação estatística entre o tempo desde a infecção pelo HIV até o início do tratamento e o nível total de DNA do HIV após 10 anos de tratamento contínuo em uma coorte de adultos tratados pela primeira vez com infecção precoce (22). Nas crianças, o nível de ADN do VIH foi marcadamente mais baixo quando o controlo viral foi alcançado antes de 1 ano de idade (23). Em comparação com outros marcadores, o ADN total do VIH tem a vantagem de ser fácil quantificação por PCR padronizada, sensível e em tempo real, incluindo PCR digital de gotículas (ddPCR) (24).

A ativação imunológica generalizada é uma marca registrada da infecção pelo HIV-1. Neste estado, uma variedade de células imunes apresentam aumento na expressão de ativação, proliferação e marcadores apoptóticos, renovação celular com regulação aberrante do ciclo celular, produção de citocinas pró-inflamatórias e aumento da fibrose do tecido linfóide (25). A activação imunitária está fortemente associada à progressão da doença VIH-1; por exemplo, a activação de células T, medida pela expressão de CD38 e HLA-DR, é mais preditiva de depleção de células T CD4+ e de sobrevivência mais curta do que a carga viral plasmática (26, 27). Além disso, o nível de activação imunitária precoce na infecção pelo VIH-1, medido pela activação das células T CD8+, prevê a perda de células T CD4+ independentemente dos níveis plasmáticos de ARN do VIH-1 (28). A supressão da replicação viral com tratamento anti-retroviral (TARV) eficaz reduz a activação imunitária, mas mesmo regimes de TARV eficazes são incapazes de reduzir os níveis de activação imunitária em indivíduos infectados pelo VIH para níveis observados em indivíduos saudáveis ​​(25). As crianças infectadas pelo VIH, mesmo que tratadas com sucesso com TARV, enfrentam uma vida inteira de activação imunitária elevada. Assim, avaliar o impacto potencial da activação imunitária crónica e da inflamação no sistema imunitário em desenvolvimento e no resultado da doença na infecção pediátrica pelo VIH é de particular importância. Estudos recentes mostraram que a ativação imunológica (HLA-DR, CD38) e os marcadores de exaustão (Tim-3, PD-1, Lag-3) estão fortemente associados ao tamanho do reservatório em adultos tratados com TARV, portanto, pode-se antecipar que a minimização do impacto viral O reservatório com TAR precoce pode, igualmente, minimizar o nível de activação imunitária e as doenças de “envelhecimento” não relacionadas com a SIDA associadas à activação imunitária persistente.

Existem evidências limitadas na caracterização dos reservatórios de VIH na região da África Ocidental e Central, um cenário geográfico com maior variabilidade nas estirpes circulantes de VIH-1 e VIH-2 (29, 30). Por exemplo, Camarões, um epicentro zoonótico do HIV-1, é anfitrião de um cenário extensivamente diversificado de HIV impulsionado pelo recombinante CRF02_AG, incluindo a maioria dos (sub) subtipos do grupo M, uma vasta gama de URFs e CRFs, e grupo N, Vírus O, P e HIV-2(31-33). Assim, a geração de dados de base sobre o perfil genotípico e quantitativo do reservatório viral em vários clados do VIH em locais como os Camarões informaria a concepção de estratégias óptimas para a cura do VIH. Considerando a vulnerabilidade acima mencionada de adolescentes com infecção vertical e o conhecimento limitado sobre reservatórios virais e ativação imunológica/reação inflamatória nesta população, as evidências geradas a partir deste alvo serão altamente complementares aos atuais esforços globais. Tais evidências, geradas num contexto de elevado fardo de co-infecções (34, 35), podem retratar mecanismos diferenciais de persistência do VIH distantes dos relatados noutras partes do mundo.

Trabalho preliminar:

No âmbito do estudo READY da EDCTP em curso, criámos uma coorte de 292 adolescentes infectados verticalmente (10-19 anos) que recebem TARV nos Camarões. Nesta coorte, relatamos uma taxa de 40% de carga viral indetectável (<40 cópias/mL) após uma mediana de 8 anos de TARV, cerca de 20% de taxa de falha imunológica (CD4<250 células/mm3) e menos de 10% de taxa clínica fracasso (ou seja, Estágios III/IV da OMS) (36). Esta população oferece uma oportunidade única para compreender o tamanho e a natureza do reservatório, a variabilidade da resposta imune/perfil de citocinas e o efeito do subtipo viral, histórico de tratamento (regime e duração de TARV), disparidades de gênero e nível de adesão no controle de reservatório viral.

MIRAR:

O objectivo deste estudo é caracterizar os reservatórios do VIH e a sua variabilidade de acordo com os perfis virológicos e imunológicos de adolescentes infectados verticalmente que recebem terapia anti-retroviral nos Camarões e, portanto, melhorar a compreensão dos reservatórios virais e fornecer dados precisos e fiáveis ​​para a investigação da cura do VIH.

Objetivos específicos:

Neste estudo iremos: 1- Determinar a variabilidade genética do HIV-1 e a resistência aos medicamentos em reservatórios celulares; 2- Caracterizar a ativação/inflamação imunológica em adolescentes infectados verticalmente pelo HIV-1; 3- Avaliar o tamanho do reservatório de HIV; 4- Avaliar o efeito da terapia antirretroviral e da resposta imune no perfil do reservatório viral.

Materiais e Métodos Desenho do estudo Planejamos realizar um estudo observacional e comparativo entre adolescentes que vivem com HIV e recebem TARV nos Camarões. Os participantes serão selecionados e inscritos a partir de uma coorte existente de cerca de 300 adolescentes com infeção vertical recrutados para o estudo EDCTP-READY.

O principal objectivo do estudo EDCTP-READY foi avaliar a resposta ao tratamento, a resistência aos medicamentos e a variabilidade do VIH-1 entre adolescentes em terapêutica anti-retroviral de primeira e segunda linha nos Camarões (7). Neste estudo, recrutamos 296 adolescentes HIV+ e comparamos o perfil genotípico do HIV-1 no RNA circulante. De 30% (89/296) APHI apresentando falência virológica (VL>1000 cópias/mL).

Método de amostragem:

Amostras de sangue serão coletadas dos participantes do estudo EDCTP-READY de acordo com os critérios de elegibilidade.

Critério de eleição:

Critérios de inclusão: Serão incluídos no estudo adolescentes HIV+ de 10 a 19 anos, infectados verticalmente, em uso de TARV há pelo menos 12 meses, que forneçam seu consentimento por escrito e cujo responsável legal forneça consentimento por procuração por escrito.

Critérios de não inclusão: Não serão considerados para inscrição adolescentes HIV+ com histórico incompleto de TARV, coinfecções HBV/HCV e malária.

Critério de exclusão: Será considerado excluído do estudo qualquer participante que decida livremente desistir após ter dado consentimento ou impossibilitado de fornecer amostra de sangue.

Tamanho amostral: O tamanho amostral mínimo (N) do estudo é de 90 participantes, calculado com base na seguinte fórmula: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 por braço (braço-A: CV<40 cópias/mL; braço-B: CV 40-999 cópias/mL; braço-C: carga viral ≥1000 cópias/mL). P é a prevalência de adolescentes que vivem com HIV nos Camarões com P=2% [3]; α sendo o risco concorda com α = 5%; Zα sendo a pequena lacuna com Zα = 1,96.

NB: Um grupo de 30 adolescentes HIV negativos servirá como controle para o perfil imunológico.

Será atribuído a todos os participantes um novo número de identificação e os dados serão centralizados num computador protegido por palavra-passe no Centro Internacional de Referência Chantal Biya (CIRCB) para investigação sobre prevenção e gestão do VIH/SIDA.

Procedimentos e variáveis ​​do estudo Procedimentos e cronogramas O presente estudo requer 18 meses para ser concluído: 3 meses (mês 1-3) para administração e aprovação ética, 12 meses (mês 4 a 15) para inscrição de participantes, amostragem e análises laboratoriais, 3 meses (mês 16 a 18) para processamento de dados e relatórios, consulte o gráfico de Gantt para obter mais detalhes.

Com base nos critérios de inclusão, os formulários de notificação de casos de adolescentes VIH+ serão selecionados do estudo EDCTP-READY e o seu responsável legal será contactado. O consentimento e o consentimento informado por procuração serão obtidos dos adolescentes e do responsável legal, respectivamente. Os dados sociodemográficos, clínicos e o histórico de TAR serão avaliados novamente para o período durante a inscrição no estudo EDCTP-READY. Em seguida, 90 ou mais adolescentes HIV+ [30 por braço (braço-A: CV <40 cópias/mL; braço-B: CV 40-999 cópias/mL; braço-C: carga viral ≥1000 cópias/mL)] serão inscritos . Um grupo de 30 adolescentes HIV negativos será inscrito para servir como controle para perfil imunológico. Sangue intravenoso (5ml x 2) será coletado por um flebotomista treinado para análises laboratoriais, incluindo isolamento de PBMCs, isolamento de plasma e camada leucocitária, contagens de CD4/CD8, carga viral plasmática (PVL), avaliação de ativação imunológica/marcadores inflamatórios, HIV-RNA e Genotipagem HIV-DNA, quantificação de reservatórios virais.

Os participantes HIV negativos serão recrutados no CIRCB, instituição que é centro de referência no manejo de indivíduos infectados pelo HIV desde 2006 e, como tal, é um renomado centro de referência para testagem de HIV. Com base nesta vantagem, o CIRCB organiza testes gratuitos de rastreio do VIH/HBV/HCV para diversas instituições e comunidades por ano, portanto, uma campanha semelhante de testes gratuitos será organizada numa escola secundária próxima e o presente estudo será apresentado àqueles que preencham os critérios de inclusão. . Os potenciais participantes serão convidados no CIRCB acompanhados do seu responsável legal para inscrição.

As amostras serão coletadas apenas uma vez no momento da inscrição, bem como todos os dados sociodemográficos e clínicos relevantes. As amostras serão transportadas para o CIRCB no mesmo dia para isolamento de PBMCs, isolamento de DNA, plasma e camada leucocitária, contagem de CD4/CD8 e avaliação de marcadores de ativação/inflamatórios por citometria de fluxo. O plasma será coletado e armazenado a -80oC para carga viral plasmática (PVL), genotipagem, avaliação de ativação imunológica/marcadores inflamatórios por meio de testes ELISA (ou citometria de fluxo). O DNA-HIV será posteriormente extraído de PBMCs e armazenado a -80oC; O DNA do HIV será enviado a cada três meses para o departamento de medicina experimental da Universidade de Roma Tor Vergata, Roma, Itália, para quantificação do reservatório viral do HIV (ver carta de colaboração na seção anexa).

Procedimentos laboratoriais Contagem de CD4/CD8: As medições de CD4/CD8 serão determinadas usando máquina de citometria de fluxo conforme descrito anteriormente (37).

Carga viral plasmática: A carga viral plasmática será determinada usando o sistema em tempo real m 2000rt Abbott conforme descrito anteriormente (38).

Extração de HIV-RNA: O ARN será extraído de amostras de plasma usando Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) conforme descrito pelo fabricante.

Extração de DNA pró-viral da camada leucocitária: O DNA pró-viral será extraído usando o kit de extração de sangue e tecido DNeasy (Qiagen) conforme descrito pelo fabricante.

Isolamento de PBMCs: PBMCs serão isolados por centrifugação em gradiente de densidade usando Ficoll usando um protocolo interno.

Extração de DNA de HIV de PBMCs: O DNA de HIV será extraído usando QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) conforme descrito pelo fabricante.

Amplificação e sequenciamento dos genes do HIV-1: O sequenciamento Sanger para testes de resistência aos medicamentos do HIV-1 será realizado para adolescentes com falha virológica em um protocolo interno, conforme descrito anteriormente por nosso grupo de pesquisa(39). As sequências de DNA da transcriptase reversa serão analisadas para mutações de resistência a medicamentos usando o algoritmo de interpretação de resistência genotípica do banco de dados da Universidade de Stanford (www.stanford.edu).

Análise filogenética: As árvores filogenéticas vizinhas serão criadas usando o software MEGA (modelo Kimura de 2 parâmetros, 200 replicações de bootstrap) e FigTree (40, 41).

Perfil imunológico: Ambas as citocinas de ativação imunológica/inflamatórias (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 e TNF-alfa) serão avaliadas usando kits comerciais de ELISA e citometria de fluxo.

Quantificação de reservatórios virais de HIV: os reservatórios virais serão quantificados usando PCR digital de gotículas (ddPCR) conforme descrito anteriormente. É digno de nota que esta quantificação será realizada no departamento de medicina experimental da Universidade de Roma Tor Vergata, Roma, Itália, conforme indicado na carta de colaboração encontrada no anexo desta proposta. Uma transferência de material e um acordo de compartilhamento de dados serão assinados entre o CIRCB e a UTV antes do envio da amostra para a UTV. É um protocolo interno para o subtipo B do VIH-1 e será ajustado para subtipos não B do VIH-1 esperados em amostras dos Camarões.

Análise de dados Os dados coletados durante o estudo serão analisados ​​utilizando o software SPSS. Os fatores associados serão avaliados por meio de regressão logística multivariada, com abordagem de estimativa do efeito imparcial de diferentes parâmetros. Os dados serão relatados como mediana. Testes não paramétricos serão utilizados para dados não normalmente distribuídos, comparações de medianas entre diferentes grupos (sucesso virológico vs falha virológica) serão realizadas pelo teste U-Mann-Whitney. As correlações serão feitas com o teste de Spearman e valores de p inferiores a 0,05 serão considerados estatisticamente significativos.

Considerações éticas Este estudo será conduzido de acordo com a declaração de Helsinque sobre princípios éticos para pesquisas médicas envolvendo seres humanos. A autorização ética será obtida do Comitê Nacional de Ética dos Camarões para pesquisas em saúde humana. após uma notificação informada sobre o estudo, uma procuração informada por escrito será obtida do responsável legal, e um consentimento por escrito também será obtido do adolescente HIV+ participante, sem qualquer coerção. A privacidade e a confidencialidade serão garantidas, através da utilização de identificadores únicos e de uma base de dados protegida por palavra-passe e serão acedidas apenas por pessoal autorizado. Os participantes serão livres para abandonar deliberadamente o estudo a qualquer momento, sem qualquer efeito no seu monitoramento de rotina na clínica do estudo. A flebotomia será não invasiva (punção venosa) e será realizada por enfermeira treinada.

Garantia da Qualidade:

Nossa equipe de estudo incluirá um oficial de garantia de qualidade que será responsável por todos os POPs do protocolo do estudo e gerenciará os testes de proficiência e a validação de dados durante todo o estudo.

Gerenciamento de riscos potenciais: Os riscos para os pacientes são mínimos, pois o único procedimento ao qual o voluntário é submetido é a punção venosa por flebotomista ou médico. A punção venosa pode ser levemente dolorosa, mas praticamente sem risco de complicações. Os riscos potenciais para os indivíduos, nenhum dos quais é provável de ocorrer, podem incluir dor momentânea, hematomas no local ou possível (mas extremamente improvável) infecção. Se tais complicações surgirem, o participante receberá tratamento médico de emergência.