Характеристика резервуаров ВИЧ-1 у ВИЧ-1-инфицированных подростков, не инфицированных В, получающих АРТ в Камеруне (AVIR)

Название: Характеристика вирусных резервуаров среди подростков с вертикальной инфекцией ВИЧ-1, не относящихся к группе B, получающих антиретровирусную терапию в Камеруне.

Акроним: AVIR-исследование, Подростковый вирусный резервуар.

Важность и актуальность Страны Африки к югу от Сахары (АЮС) непропорционально сильно затронуты ВИЧ/СПИДом, на них приходится около 70% глобальных эпидемий. При самом высоком бремени ВИЧ-инфекции среди детей около девяти из каждых десяти детей, живущих с ВИЧ, приходится на регион АЮС (1, 2). Подростки и молодые люди составляют растущую долю людей, живущих с ВИЧ во всем мире. В 2019 году около 1,7 млн ​​[1,1 млн-2,4 миллионов] подростков в возрасте от 10 до 19 лет жили с ВИЧ во всем мире, что составляет около 5% всех людей, живущих с ВИЧ, около 1,5 миллиона [1,0–2,1 миллиона] или 88% ВИЧ-инфицированных подростков проживают в странах Африки к югу от Сахары. Только в 2019 году 460 000 [260 000–680 000] молодых людей в возрасте от 10 до 24 лет были впервые инфицированы ВИЧ, из которых 170 000 [53 000–340 000] были подростками в возрасте от 10 до 19 лет. Вдобавок к этому, самые последние данные показывают, что только 27% девочек-подростков и 16% мальчиков-подростков в возрасте 15-19 лет в Восточной и Южной Африке – регионе, наиболее затронутом ВИЧ – прошли тестирование на ВИЧ за последние 12 месяцев и получили результат последнего теста. Уровень тестирования в Западной и Центральной Африке и Южной Азии еще ниже. Если нынешние тенденции сохранятся, в ближайшие годы еще сотни тысяч людей станут ВИЧ-положительными, и, не зная своего статуса, подростки лишатся жизненно важного лечения. Кроме того, большая популяция детей, инфицированных ВИЧ перинатально за последнее десятилетие, достигла подросткового возраста (3). Из примерно 690 000 человек, умерших от заболеваний, связанных со СПИДом, в 2019 году 110 000 (или примерно 16%) были детьми в возрасте до 20 лет. (Глобальные и региональные тенденции ЮНИСЕФ, июль 2020 г.).

С появлением и масштабированием антиретровирусной терапии (АРТ) наблюдается глобальное снижение смертности, связанной со СПИДом. По состоянию на конец 2019 года антиретровирусную терапию получали 25,4 миллиона человек, что составляет 67% всех людей, живущих с ВИЧ. Однако только 53% детей, живущих с ВИЧ, получали АРТ. Интересно, что около 94% всех детей, получающих АРТ, происходят из стран ССА (4). В этом контексте постоянных новых случаев ВИЧ-инфекции у детей и увеличения охвата педиатрической АРТ число детей, живущих с ВИЧ, будет увеличиваться, что предполагает более высокую вероятность достижения подросткового возраста и даже взрослой жизни, если схемы лечения останутся полностью эффективными в борьбе с ВИЧ-инфекцией (3, 4). Таким образом, ADLHIV представляет собой популяцию ВИЧ-инфекции, вызывающую растущую озабоченность здоровьем и имеющую очень ограниченные данные по обобщаемым передовым практикам, специфичным для этой целевой группы населения, особенно в странах Африки к югу от Сахары.

Как и некоторые страны Западной и Центральной Африки, Камерун по-прежнему сталкивается с генерализованной эпидемиологией ВИЧ (распространенность 2,7%) (5), с более высокой распространенностью среди беременных женщин (5,7%) и ВИЧ-инфицированных младенцев/детей (5,8% [958/16,638] ] положительность при первой ПЦР и 15% в конце каскада ППМР) (6). По состоянию на июнь 2018 года национальный охват АРТ составил 51,5% (281 083), включая 12 362 детей в возрасте до 15 лет (6). Что касается ответа на АРТ в Камеруне, мы сообщили об общем уровне подавления вируса в 79,4% со значительными различиями в разных возрастных диапазонах: 81,1% у взрослых, 75,6% у детей и только 53,3% у подростков в возрасте 10-19 лет (7). Как и в отчетах ЮНЭЙДС, подростки, живущие с ВИЧ (ADLHIV), представляют собой наиболее уязвимую и недостаточно обслуживаемую группу населения в ответ на эпидемии (1, 5). Для более безопасного роста к взрослой жизни необходимо сделать эту группу населения приоритетной для поиска инновационных стратегий лечения, которые обеспечат их благополучие и их вклад в развитие САС.

Несмотря на неоспоримые преимущества АРТ, существующие стратегии лечения имеют ограничения. Следует отметить, что нынешний характер АРТ в течение всей жизни сопровождается проблемами, связанными с соблюдением режима лечения для большинства пациентов, токсичность, связанная с АРТ, и сохраняющаяся иммунная дисфункция приводят к серьезным нарушениям здоровья, а лекарственная устойчивость ВИЧ (ЛУВИЧ) растет, в основном в странах АЮС, где большинство людей, уже получавших АРТ, больные живы (8). Существует угроза возникновения новой эпидемии ВИЧ, вызванной резистентностью ВИЧ к существующим антиретровирусным препаратам. Эти проблемы особенно актуальны для педиатрической популяции из-за ограниченных возможностей АРТ, плохих рецептур лекарств и увеличения случаев несоблюдения режима лечения по мере приближения к подростковому возрасту. Эти проблемы требуют разработки подходов к (функциональному) излечению или ремиссии ВИЧ, особенно для наиболее уязвимых групп населения (т.е. АДЛИЧ) (7, 9).

Концепции, лежащие в основе проекта, включая идеи, модели и предположения, стратегии ремиссии или ликвидации ВИЧ-1 направлены на достижение вирусной ремиссии в отсутствие антиретровирусной терапии (АРТ). Разработка лекарства от ВИЧ-1 остается сложной задачей из-за скрытых резервуаров. Латентный резервуар ВИЧ-1 (LR) можно определить как фракцию клеток, несущих транскрипционно молчащую провирусную ДНК, которая способна продуцировать инфекционные вирионы после активации (10). Клетки CD4T покоящейся памяти являются основным хозяином LR, но инфицирование ВИЧ-1 в этих клетках неэффективно из-за низкой экспрессии их корецепторов и присущих ограничений обратной транскрипции (11, 12). Тем не менее, есть доказательства того, что ВИЧ-1 может инфицировать покоящиеся клетки CD4T напрямую или посредством передачи от клетки к клетке, хотя инфицирование этих клеток связано с более медленной кинетикой репликации (13). Альтернативно, латентный период устанавливается, когда подмножество инфицированных активированных клеток CD4T возвращается к фенотипу покоящейся памяти, эффективно подавляя экспрессию вирусных генов и одновременно поддерживая провирусную ДНК в течение длительного времени (14). Провирус поддерживается в этих клетках в состоянии покоя посредством факторов хозяина, таких как эпигенетическая супрессия, истощение факторов транскрипции, таких как NF-κB, и транскрипционная интерференция из-за интеграции в экспрессируемые гены, которые рассматриваются более подробно (15). Отскок вируса из LR после прекращения АРТ происходит быстро, что приводит к обнаруживаемой виремии в течение нескольких недель после прерывания терапии (16). Кроме того, начало АРТ на ранней стадии инфекции недостаточно, чтобы остановить образование LR, что позволяет предположить, что LR устанавливается и распространяется на ранней стадии (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), даже у вертикально инфицированных детей, которые начали АРТ вскоре после рождения (17). Латентный резервуар стабилен, несмотря на годы супрессивной АРТ, и является источником рикошета виремии после прерывания терапии. Таким образом, латентно инфицированные клетки представляют собой главный барьер на пути излечения от ВИЧ-1 и должны быть специально нацелены на новые стратегии лечения и ликвидации.

Прогресс в разработке функционального или стерилизующего лекарства от ВИЧ-1 существенно затруднен из-за присутствия LR. В настоящее время два человека излечились от инфекции ВИЧ-1, так называемые берлинские и лондонские пациенты, у которых с момента получения аллогенной трансплантации стволовых клеток от доноров CCR5?32/?32 стабильно были отрицательные результаты тестов на отскок вируса в течение более чем 10 и 2 лет. лет соответственно без АРТ (18). В этих случаях пул инфицированных клеток был значительно истощен во время предтрансплантационного кондиционирования и заменен донорскими клетками, устойчивыми к заражению R5-тропным вирусом, из-за большой делеции корецептора CCR5 (19). Из-за относительной нехватки доноров CCR5 ?32/?32 и уникальных обстоятельств, предопределяющих эти случаи, этот тип лечения невозможен для широкого использования, однако он подчеркивает основной принцип лечения ВИЧ-1; заставить замолчать или искоренить LR ВИЧ-1 (20). За последнее десятилетие понимание того, где и как ВИЧ персистирует у лиц, получающих АРТ, существенно изменилось, поскольку появились доказательства того, что вирус персистирует во многих типах клеток и участках тканей, а также в покоящихся и пролиферирующих долгоживущих латентно инфицированных клетках. Таким образом, в рамках супрессивного лечения точная оценка вирусного резервуара поможет лучше освоить персистенцию вируса, что, в свою очередь, может преодолеть существующие препятствия на пути к излечению (21).

Тотальная ДНК ВИЧ является эталонным биомаркером, который включает как интегрированную, так и неинтегрированную ДНК ВИЧ и отражает глобальный уровень вирусного резервуара. Важно отметить, что Бузон и др. сообщили о статистической корреляции между временем от ВИЧ-инфекции до начала лечения и общим уровнем ДНК ВИЧ после 10 лет непрерывного лечения в когорте взрослых, впервые получавших лечение на ранней стадии инфекции (22). У детей уровень ДНК ВИЧ был заметно ниже, когда вирусный контроль был достигнут в возрасте до 1 года (23). По сравнению с другими маркерами общая ДНК ВИЧ имеет преимущество, заключающееся в простоте количественного определения с помощью стандартизированной чувствительной ПЦР в реальном времени, включая цифровую капельную ПЦР (ддПЦР) (24).

Генерализованная иммунная активация является отличительным признаком инфекции ВИЧ-1. В этом состоянии различные иммунные клетки демонстрируют увеличение экспрессии маркеров активации, пролиферации и апоптоза, клеточный оборот с аберрантной регуляцией клеточного цикла, выработку провоспалительных цитокинов и усиление фиброза лимфоидной ткани (25). Активация иммунитета тесно связана с прогрессированием заболевания ВИЧ-1; например, активация Т-клеток, измеряемая по экспрессии CD38 и HLA-DR, более предсказывает истощение CD4+Т-клеток и более короткую выживаемость, чем вирусная нагрузка в плазме (26, 27). Более того, уровень иммунной активации на ранних стадиях ВИЧ-1-инфекции, измеряемый по активации CD8+Т-клеток, предсказывает потерю CD4+Т-клеток независимо от уровней РНК ВИЧ-1 в плазме (28). Подавление репликации вируса с помощью эффективной антиретровирусной терапии (АРТ) снижает активацию иммунитета, но даже эффективные схемы АРТ не способны снизить уровень активации иммунитета у ВИЧ-инфицированных лиц до уровней, наблюдаемых у здоровых людей (25). ВИЧ-инфицированные дети, даже если их успешно лечат АРТ, на протяжении всей жизни сталкиваются с повышенной иммунной активацией. Таким образом, оценка потенциального влияния хронической иммунной активации и воспаления на развивающуюся иммунную систему и исход заболевания при ВИЧ-инфекции у детей имеет особое значение. Недавние исследования показали, что иммунная активация (HLA-DR, CD38) и маркеры истощения (Tim-3, PD-1, Lag-3) тесно связаны с размером резервуара у взрослых, получающих АРТ, поэтому можно ожидать, что минимизация вирусной активности Ранняя АРТ может в равной степени свести к минимуму уровень иммунной активации и не связанные со СПИДом заболевания «старения», связанные с стойкой иммунной активацией.

Имеются ограниченные данные для характеристики резервуаров ВИЧ в регионе Западной и Центральной Африки, географическом положении с самой высокой вариабельностью циркулирующих штаммов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (29, 30). Например, Камерун, зоонозный эпицентр ВИЧ-1, является местом обитания весьма разнообразного ландшафта ВИЧ, обусловленного рекомбинантом CRF02_AG, включая большинство подтипов группы M (субтипов), широкий спектр URF и CRF, а также группу N, Вирусы О, Р и ВИЧ-2(31-33). Таким образом, получение исходных данных о генотипическом и количественном профиле вирусного резервуара в нескольких кладах ВИЧ в таких условиях, как Камерун, могло бы помочь в разработке оптимальных стратегий лечения ВИЧ. Учитывая вышеупомянутую уязвимость подростков к вертикальной инфекции и ограниченность знаний о вирусных резервуарах и иммунной активации/воспалительных реакциях в этой группе населения, данные, полученные в результате этой задачи, будут в значительной степени дополнять текущие глобальные усилия. Такие данные, полученные в контексте высокого бремени коинфекций (34, 35), могут отражать различные механизмы персистенции ВИЧ, далекие от тех, о которых сообщалось в других частях мира.

Предварительная работа:

В рамках текущего исследования EDCTP READY мы сформировали группу из 292 вертикально инфицированных подростков (10–19 лет), получающих АРТ в Камеруне. В этой когорте мы сообщили о 40% неопределяемой вирусной нагрузке (<40 копий/мл) после медианы 8 лет АРТ, о 20% частоте иммунологической неудачи (CD4<250 клеток/мм3) и менее 10% клинических случаев. неудача (т. ВОЗ, этапы III/IV) (36). Эта популяция предлагает уникальную возможность понять размер и природу резервуара, изменчивость иммунного ответа/профиля цитокинов, а также влияние подтипа вируса, истории лечения (режим и продолжительность АРТ), гендерных различий и уровня приверженности лечению на контроль резервуар вируса.

ЦЕЛЬ:

Цель этого исследования — охарактеризовать резервуары ВИЧ и их вариабельность в соответствии с вирусологическими и иммунологическими профилями вертикально инфицированных подростков, получающих антиретровирусную терапию в Камеруне, и, следовательно, улучшить понимание вирусных резервуаров и предоставить точные и надежные данные для исследований по лечению ВИЧ.

Конкретные цели:

В этом исследовании мы должны: 1- Определить генетическую изменчивость ВИЧ-1 и лекарственную устойчивость в клеточных резервуарах; 2- Охарактеризовать иммунную активацию/воспаление у подростков, вертикально инфицированных ВИЧ-1; 3- Оценить размер резервуара ВИЧ; 4- Оценить влияние антиретровирусной терапии и иммунного ответа на профиль вирусного резервуара.

Материалы и методы Дизайн исследования Мы планируем провести обсервационное и сравнительное исследование среди подростков, живущих с ВИЧ и получающих АРТ в Камеруне. Участники будут выбраны и зачислены из существующей когорты, насчитывающей около 300 вертикально инфицированных подростков, набранных для исследования EDCTP-READY.

Основная цель исследования EDCTP-READY заключалась в оценке ответа на лечение, лекарственной устойчивости и вариабельности ВИЧ-1 среди подростков, получающих антиретровирусную терапию первой и второй линии в Камеруне (7). В этом исследовании мы набрали 296 ВИЧ-положительных подростков и сравнили генотипический профиль ВИЧ-1 в циркулирующей РНК. Из 30% (89/296) APHI наблюдалась вирусологическая неудача (ВЛ>1000 копий/мл).

Метод выборки:

Образцы крови будут взяты у участников исследования EDCTP-READY в соответствии с критериями отбора.

Критерии отбора:

Критерии включения: В исследование будут включены ВИЧ-положительные подростки в возрасте 10-19 лет, вертикально инфицированные, принимающие АРТ не менее 12 месяцев, предоставившие свое письменное согласие и чей законный опекун предоставит письменное доверенное согласие.

Критерии невключения: не будут учитываться для включения в исследование ВИЧ-позитивные подростки с неполным анамнезом АРТ, коинфекцией ВГВ/ВГС и малярией.

Критерии исключения: будет считаться исключенным из исследования любой участник, который решит добровольно выйти из исследования после того, как дал согласие или не смог сдать образец крови.

Размер выборки: Минимальный размер выборки (N) исследования составляет 90 участников, рассчитывается по следующей формуле: N=p (1-p) (Zα2/α2); Н = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 на группу (группа A: VL<40 копий/мл; группа B: VL 40–999 копий/мл; группа C: вирусная нагрузка ≥1000 копий/мл). P — распространенность подростков, живущих с ВИЧ, в Камеруне, P=2% [3]; α — риск соответствует α = 5%; Zα — малый зазор с Zα = 1,96.

Примечание: Группа из 30 ВИЧ-отрицательных подростков будет служить контролем при иммунологическом профилировании.

Всем участникам будет присвоен новый идентификационный номер, а данные будут централизованно храниться на защищенном паролем компьютере в Международном справочном центре Шанталь Бия (CIRCB) для исследований в области профилактики и лечения ВИЧ/СПИДа.

Процедуры и переменные исследования Процедуры и сроки Для завершения настоящего исследования требуется 18 месяцев: 3 месяца (месяцы 1–3) для утверждения администрации и этики, 12 месяцев (месяцы с 4 по 15) для набора участников, отбора проб и лабораторных анализов, 3 месяцев (с 16 по 18 месяц) для обработки данных и составления отчетов; более подробную информацию см. в диаграмме Ганта.

На основании критериев включения в исследование EDCTP-READY будут выбраны формы отчетов о случаях ВИЧ-инфицированных подростков, и с их законным опекуном свяжутся. Согласие и согласие, информированное через доверенное лицо, будут получены от подростков и законного опекуна соответственно. Социально-демографические, клинические данные и история АРТ будут снова оценены за период во время включения в исследование EDCTP-READY. Затем будут включены 90 или более ВИЧ-положительных подростков [30 на группу (группа-A: VL<40 копий/мл; группа-B: VL 40-999 копий/мл; группа-C: вирусная нагрузка ≥1000 копий/мл)] . Группа из 30 ВИЧ-отрицательных подростков будет набрана для контроля при иммунологическом профилировании. Внутривенная кровь (5 мл х 2) будет собрана обученным флеботомистом для лабораторных анализов, включая выделение РВМС, выделение плазмы и лейкоцитарной пленки, подсчет CD4/CD8, плазменную вирусную нагрузку (PVL), иммунную активацию/оценку воспалительных маркеров, РНК ВИЧ и Генотипирование ДНК ВИЧ, количественная оценка вирусных резервуаров.

ВИЧ-отрицательные участники будут набраны в CIRCB, это учреждение является справочным центром по ведению ВИЧ-инфицированных лиц с 2006 года и, как таковое, является известным справочным центром по тестированию на ВИЧ. Основываясь на этом преимуществе, CIRCB ежегодно организует бесплатные скрининговые тесты на ВИЧ/ВГВ/ВГС для нескольких учреждений и сообществ, поэтому аналогичная кампания бесплатного тестирования будет организована в близлежащей средней школе, и настоящее исследование будет представлено тем, кто соответствует критериям включения. . Потенциальные участники будут приглашены в CIRCB вместе со своим законным опекуном для регистрации.

Образцы будут собираться только один раз при зачислении, а также все соответствующие социально-демографические и клинические данные. В тот же день образцы будут доставлены в CIRCB для выделения РВМС, выделения ДНК, плазмы и лейкоцитной пленки, подсчета CD4/CD8 и оценки маркеров активации/воспалительности с использованием проточной цитометрии. Плазму собирают и хранят при температуре -80°C для определения вирусной нагрузки в плазме (ПВЛ), генотипирования, оценки иммунной активации/воспалительных маркеров с помощью тестов ELISA (или проточной цитометрии). ДНК ВИЧ будет впоследствии выделена из РВМС и сохранена при -80°C; ДНК ВИЧ будет отправляться каждые три месяца на факультет экспериментальной медицины Римского университета Тор Вергата, Рим, Италия, для количественного определения резервуара вируса ВИЧ (см. письмо о сотрудничестве в разделе приложения).

Лабораторные процедуры Подсчет CD4/CD8: Измерения CD4/CD8 будут определяться с использованием аппарата проточной цитометрии, как описано ранее (37).

Вирусная нагрузка в плазме: Вирусная нагрузка в плазме будет определяться с использованием системы реального времени m 2000rt Abbott, как описано ранее (38).

Экстракция РНК ВИЧ: ARN будет экстрагирован из образцов плазмы с использованием мини-набора вирусной РНК Qiamp (Qiagen), как описано производителем.

Экстракция провирусной ДНК из лейкоцитной пленки: Провирусную ДНК экстрагируют с использованием набора для экстракции крови и тканей DNeasy (Qiagen), как описано производителем.

Выделение РВМС: РВМС будут выделять центрифугированием в градиенте плотности с использованием фиколла по собственному протоколу.

Экстракция ДНК ВИЧ из РВМС: ДНК ВИЧ будет экстрагирована с использованием мини-набора QIAmp DNA (Qiagen), как описано производителем.

Амплификация и секвенирование генов ВИЧ-1. Секвенирование по Сэнгеру для тестирования на лекарственную устойчивость ВИЧ-1 будет проводиться для подростков, у которых наблюдается вирусологическая неудача, по собственному протоколу, как описано ранее нашей исследовательской группой (39). Последовательности ДНК обратной транскриптазы будут проанализированы на предмет мутаций устойчивости к лекарствам с использованием алгоритма интерпретации генотипической устойчивости базы данных Стэнфордского университета (www.stanford.edu).

Филогенетический анализ: Филогенетические деревья объединения соседей будут созданы с использованием программного обеспечения MEGA (2-параметрическая модель Кимуры, 200 бутстреп-репликаций) и FigTree (40, 41).

Иммунный профиль: как иммунная активация/воспалительные цитокины (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 и TNF-альфа) будут оцениваться с использованием коммерческих наборов ELISA и проточной цитометрии.

Количественная оценка вирусных резервуаров ВИЧ: вирусные резервуары будут количественно определены с помощью капельной цифровой ПЦР (ddPCR), как описано ранее. Следует отметить, что эта количественная оценка будет проводиться на факультете экспериментальной медицины Римского университета Тор Вергата, Рим, Италия, как указано в письме о сотрудничестве, которое находится в приложении к этому предложению. Перед отправкой образцов в UTV между CIRCB и UTV будет подписано соглашение о передаче материала и обмене данными. Это внутренний протокол для подтипа ВИЧ-1 B, и он будет скорректирован с учетом подтипов ВИЧ-1, отличных от B, ожидаемых в камерунских образцах.

Анализ данных Данные, собранные в ходе исследования, будут проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS. Связанные факторы будут оцениваться с использованием многомерной логистической регрессии с подходом оценки несмещенного влияния различных параметров. Данные будут представлены как медианные. Непараметрические тесты будут использоваться для данных, которые обычно не распределяются, сравнение медиан между различными группами (вирусологический успех и вирусологическая неудача) будет проводиться с помощью теста U-Манна-Уитни. Корреляции будут проводиться с помощью теста Спирмена, а значения p менее 0,05 будут считаться статистически значимыми.

Этические соображения. Это исследование будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией об этических принципах медицинских исследований с участием людей. Этическое разрешение будет получено от Национального комитета по этике Камеруна для исследований в области здоровья человека. после информированного уведомления об исследовании будет получено письменное уведомление от законного опекуна, а также будет получено письменное согласие от участвующего ВИЧ-положительного подростка без какого-либо принуждения. Конфиденциальность и конфиденциальность будут обеспечиваться за счет использования уникальных идентификаторов и базы данных, защищенной паролем, и доступ к ним будет иметь только уполномоченный персонал. Участники будут иметь право намеренно выйти из исследования в любое время без какого-либо влияния на их обычное наблюдение в исследовательской клинике. Кровопускание будет неинвазивным (венопункция) и будет выполняться обученной медсестрой.

Гарантия качества:

В нашу исследовательскую группу войдет сотрудник по обеспечению качества, который будет отвечать за все СОП протокола исследования и будет управлять проверкой квалификации и проверкой данных в течение всего исследования.

Управление потенциальными рисками: Риски для пациентов минимальны, поскольку единственная процедура, которой подвергается доброволец, — это венепункция, выполняемая флеботомистом или врачом. Венепункция может быть слегка болезненной, но практически без риска осложнений. Потенциальные риски для субъектов, ни один из которых маловероятен, могут включать кратковременную боль, синяки на месте или возможную (но крайне маловероятную) инфекцию. В случае возникновения таких осложнений участнику будет оказана неотложная медицинская помощь.