Karakterisering av HIV-1-reservoarer hos HIV-1 icke-B-infekterade ungdomar på ART i Kamerun (AVIR)

Titel: Karakterisering av virala reservoarer bland HIV-1 icke-B vertikalt infekterade ungdomar som får antiretroviral terapi i Kamerun.

Akronym: AVIR-studie, Adolescent viral reservoar

Betydelse och relevans Afrika söder om Sahara (SSA) är oproportionerligt drabbat av hiv/aids, med nära 70 % av de globala epidemierna. Med den högsta bördan av pediatriska HIV-infektioner hittade omkring nio av tio barn som lever med HIV i SSA-regionen(1, 2). Ungdomar och ungdomar representerar en växande andel av människor som lever med hiv över hela världen. Under 2019, cirka 1,7 miljoner [1,1 miljoner-2,4 miljoner] ungdomar mellan 10 och 19 år som levde med hiv över hela världen, vilket representerar cirka 5 % av alla människor som lever med hiv, cirka 1,5 miljoner [1,0 - 2,1 miljoner] eller 88 % av hiv-smittade ungdomar bor i SSA. Bara under 2019 var 460 000 [260 000-680 000] ungdomar mellan 10 och 24 år nysmittade med hiv, varav 170 000 [53 000-340 000] var ungdomar mellan 10 och 19 år. För att förstärka detta tyder de senaste uppgifterna på att endast 27 % av tonårsflickorna och 16 % av tonårspojkarna i åldrarna 15-19 i östra och södra Afrika - den region som är mest drabbad av hiv - har testats för hiv under de senaste 12 månaderna och fått resultatet av det senaste testet. Testfrekvenserna i Väst- och Centralafrika och Sydasien är ännu lägre. Om nuvarande trender fortsätter kommer hundratusentals fler att bli hiv-positiva under de kommande åren, och utan att veta sin status kommer ungdomar att gå miste om livräddande behandling. Dessutom växer en stor population av barn infekterade med HIV perinatalt under det senaste decenniet till tonåren (3). Av de uppskattningsvis 690 000 personer som dog av AIDS-relaterade sjukdomar 2019, var 110 000 (eller cirka 16%) av dem barn under 20 år. (UNICEF globala och regionala trender, juli 2020).

Med tillkomsten och skalbarheten av antiretroviral terapi (ART) sker en global minskning av AIDS-relaterade dödsfall. I slutet av 2019 hade 25,4 miljoner människor tillgång till antiretroviral behandling, vilket motsvarar 67 % av alla människor som lever med hiv. Men bara 53% av barn som lever med HIV fick ART. Intressant nog är cirka 94 % av alla barn som får ART från SSA (4). I detta sammanhang med kontinuerliga nya HIV-infektioner hos barn och ökande täckning inom pediatrisk ART, kommer antalet barn som lever med HIV att öka, vilket tyder på en högre sannolikhet att nå tonårsåldern och till och med vuxen ålder om behandlingsregimerna förblir fullt effektiva för att kontrollera HIV-infektion (3, 4). ADLHIV utgör därför en HIV-population med växande hälsoproblem och med mycket begränsade resultat för generaliserbara bästa praxis specifika för denna målpopulation, särskilt i SSA.

Liksom flera väst- och centralafrikanska länder står Kamerun fortfarande inför en generaliserad HIV-epidemiologi (2,7 % prevalens) (5), med högre prevalens bland gravida kvinnor (5,7 %) och HIV-exponerade spädbarn/barn (5,8 % [958/16 638) ] positivitet vid första PCR och 15 % i slutet av PMTCT-kaskaden) (6). I juni 2018 var den nationella täckningen av ART 51,5 % (281 083), vilket inkluderar 12 362 barn under 15 år (6). När det gäller svaret på ART i Kamerun rapporterade vi en total frekvens på 79,4% virusdämpning, med betydande skillnader mellan åldersintervall: 81,1% hos vuxna, 75,6% hos barn och endast 53,3% hos ungdomar i åldern 10-19 år (7). I likhet med UNAIDS-rapporter representerar ungdomar som lever med HIV (ADLHIV) den mest utsatta och undertjänade befolkningen som svar på epidemierna(1, 5). För en säkrare tillväxt mot vuxen ålder måste denna befolkning prioriteras i strävan efter innovativa behandlingsstrategier som säkerställer deras välbefinnande och deras bidrag till utvecklingen av SSA.

Trots de obestridliga fördelarna med ART finns det begränsningar med nuvarande behandlingsstrategier. Notera att den livslånga karaktären av nuvarande ART går med utmaningsrelaterad adherens för de flesta patienter, ART-tillskrivna toxiciteter och ihållande immundysfunktion har betydande hälsoförsämringar, och HIV-läkemedelsresistens (HIVDR) ökar, mestadels i SSA-länder där de flesta ART-erfarna patienter lever (8). Det finns ett hot om en framväxande ny HIV-epidemi, driven av HIVDR till befintliga antiretrovirala medel. Dessa utmaningar gäller särskilt för pediatriska populationer på grund av begränsade ART-alternativ, dåliga läkemedelsformuleringar och ökande händelser av icke-följsamhet när de växer mot tonåren. Dessa utmaningar kräver tillvägagångssätt mot HIV (funktionell) bot eller remission, särskilt för de mest utsatta befolkningarna (dvs. ADLHIV) (7, 9).

Koncept som ligger till grund för projektet inklusive idéer och modeller eller antaganden HIV-1 remission eller utrotningsstrategier syftar till att uppnå viral remission i frånvaro av antiretroviral terapi (ART). Utvecklingen av ett botemedel mot HIV-1 är fortfarande utmanande på grund av de latenta reservoarerna. HIV-1 Latent Reservoir (LR) kan definieras som den del av celler som har transkriptionellt tyst proviralt DNA som kan producera infektiösa virioner efter aktivering(10). CD4T-celler i vilarminne är den primära värden för LR men HIV-1-infektion i dessa celler är ineffektiv på grund av deras låga co-receptoruttryck och inneboende restriktioner för omvänd transkription (11, 12). Ändå finns det bevis för att HIV-1 kan infektera vilande CD4T-celler direkt eller via cell-till-cell-överföring, även om infektion i dessa celler är förknippad med långsammare replikationskinetik (13). Alternativt etableras latens när en undergrupp av infekterade, aktiverade CD4T-celler återgår till en vilande minnesfenotyp, vilket effektivt tystar viralt genuttryck samtidigt som det upprätthåller det provirala DNA:t på lång sikt(14). Proviruset bibehålls i ett vilande tillstånd i dessa celler via värdfaktorer såsom epigenetisk suppression, utarmning av transkriptionsfaktorer såsom NF-KB och transkriptionsinterferens på grund av integrering i uttryckta gener, granskad mer i detalj (15). Viral återhämtning från LR efter upphörande av ART är snabb, vilket leder till detekterbar viremi inom veckor efter behandlingsavbrott (16). Dessutom är det inte tillräckligt att initiera ART tidigt i infektionen för att stoppa bildandet av LR, vilket tyder på att LR etableras och sprids tidigt (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), även hos vertikalt infekterade barn som började ART strax efter födseln (17). Den latenta reservoaren är stabil trots år av suppressiv ART och är källan till rebound-viremi efter behandlingsavbrott. Latent infekterade celler utgör därför den huvudsakliga barriären för ett botemedel mot HIV-1 och bör specifikt riktas mot nya behandlings- och utrotningsstrategier.

Framstegen mot utvecklingen av ett funktionellt eller steriliserande botemedel mot HIV-1 har avsevärt hindrats av närvaron av LR. För närvarande har två personer botats från HIV-1-infektion, de så kallade Berlin- och Londonpatienterna, som sedan de fått allogena stamcellstransplantationer från CCR5?32/?32-donatorer, konsekvent har testat negativt för viral rebound i över 10 och 2 år, respektive utan ART (18). I dessa fall utarmades den infekterade cellpoolen avsevärt under konditionering före transplantation och ersattes med donatorceller som är resistenta mot infektion med R5-tropiskt virus på grund av en stor deletion i CCR5-koreceptorn (19). På grund av den relativa bristen på CCR5 ?32/?32-donatorer och de unika omständigheterna som förutbestämmer dessa fall, är denna typ av botemedel inte genomförbar för utbredd användning, den betonar dock den grundläggande principen för HIV-1-bot; tysta eller utrota HIV-1 LR (20). Under det senaste decenniet har förståelsen för var och hur HIV kvarstår hos individer på ART förändrats avsevärt med bevis för att virus kvarstår i flera celltyper och vävnadsplatser, och i både vilande och prolifererande långlivade latent infekterade celler. Sålunda, inom ramen för en undertryckande behandling, skulle noggranna uppskattningar av den virala reservoaren hjälpa till att bättre bemästra viral persistens, vilket i sin tur kan övervinna befintliga barriärer för att uppnå ett botemedel(21).

Total HIV-DNA är en referensbiomarkör som inkluderar både integrerat och ointegrerat HIV-DNA och återspeglar den globala nivån av virusreservoaren. Viktigt är att Buzon et al. rapporterade en statistisk korrelation mellan tiden från HIV-infektion till behandlingsstart och den totala HIV-DNA-nivån efter 10 års kontinuerlig behandling i en kohort av vuxna som först behandlades med tidig infektion (22). Hos barn var HIV-DNA-nivån markant lägre när viral kontroll uppnåddes före 1 års ålder (23). I jämförelse med andra markörer har totalt HIV-DNA fördelen av enkel kvantifiering genom standardiserad, känslig, realtids-PCR, inklusive digital dropp-PCR (ddPCR) (24).

Generaliserad immunaktivering är ett kännetecken för HIV-1-infektion. I detta tillstånd visar en mängd olika immunceller ett ökat uttryck av aktiverings-, proliferations- och apoptotiska markörer, cellomsättning med avvikande cellcykelreglering, produktion av pro-inflammatoriska cytokiner och ökad lymfoidvävnadsfibros (25). Immunaktivering är starkt associerad med HIV-1-sjukdomsprogression; till exempel är T-cellsaktivering, mätt genom uttryck av CD38 och HLA-DR, mer förutsägande för utarmning av CD4+T-celler och kortare överlevnad än plasmavirusmängden (26, 27). Vidare förutsäger nivån av immunaktivering tidigt i HIV-1-infektion mätt med CD8+T-cellsaktivering CD4+T-cellförlust oberoende av plasma HIV-1 RNA-nivåer (28). Undertryckande av viral replikation med effektiv antiretroviral behandling (ART) minskar immunaktiveringen, men inte ens effektiva ART-kurer kan minska nivåerna av immunaktivering hos HIV-infekterade individer till nivåer som ses hos friska individer (25). HIV-infekterade barn, även om de behandlas framgångsrikt med ART, möter en livstid av förhöjd immunaktivering. Att utvärdera den potentiella inverkan av kronisk immunaktivering och inflammation på det utvecklande immunsystemet och på sjukdomsutfallet vid pediatrisk HIV-infektion är därför av särskild vikt. Nyligen genomförda studier visade att immunaktivering (HLA-DR, CD38) och utmattningsmarkörer (Tim-3, PD-1, Lag-3) är starkt förknippade med reservoarstorlek hos ART-behandlade vuxna, så det kan förväntas att minimera viruset reservoar med tidig ART kan på samma sätt minimera nivån av immunaktivering och icke-AIDS "åldrande" sjukdomar associerade med ihållande immunaktivering.

Det finns begränsade bevis för att karakterisera HIV-reservoarer i västra och centralafrikanska regioner, en geografisk miljö som har den största variationen i cirkulerande HIV-1- och HIV-2-stammar (29, 30). Till exempel, Kamerun, ett zoonotiskt epicentrum av HIV-1, är värd för ett omfattande varierat landskap av HIV som drivs av CRF02_AG rekombinant, inklusive de flesta grupp M (under-) subtyper, ett stort antal URF och CRF, och grupp N, O-, P- och HIV-2-virus (31-33). Att generera baslinjedata om den genotypiska och kvantitativa profilen för den virala reservoaren över flera HIV-klader i miljöer som Kamerun skulle således informera utformningen av optimala strategier för HIV-bot. Med tanke på den tidigare nämnda sårbarheten hos ungdomar med vertikal infektion och den begränsade kunskapen om virala reservoarer och immunaktivering/inflammatorisk reaktion i denna population, kommer bevis som genereras från detta mål att vara mycket komplementära till nuvarande globala ansträngningar. Sådana bevis, genererade i ett sammanhang med hög börda av samtidiga infektioner (34, 35), kan visa olika mekanismer för hiv-persistens långt från de som rapporterats i andra delar av världen.

Preliminärt arbete:

Inom ramen för den pågående EDCTP READY-studien har vi skapat en kohort av 292 vertikalt infekterade ungdomar (10-19 år) som får ART i Kamerun. I denna kohort rapporterade vi en frekvens av 40 % odetekterbar virusmängd (<40 kopior/ml) efter en median på 8 år av ART, cirka 20 % immunologisk misslyckande (CD4<250 celler/mm3) och mindre än 10 % klinisk misslyckande (dvs. WHO steg III/IV) (36). Denna population erbjuder en unik möjlighet att förstå reservoarens storlek och natur, variationen av immunsvar/cytokinprofilering och effekten av viral subtyp, behandlingshistoria (ART-regim och varaktighet), könsskillnader och vidhäftningsnivå på kontrollen av viral reservoar.

SYFTE:

Syftet med denna studie är att karakterisera HIV-reservoarer och deras variabilitet enligt virologiska och immunologiska profiler hos vertikalt infekterade ungdomar som får antiretroviral terapi i Kamerun, och därför förbättra förståelsen av virala reservoarer och tillhandahålla korrekta och tillförlitliga data för forskning om HIV-bot.

Specifika mål:

I denna studie ska vi: 1- Bestäm HIV-1 genetisk variabilitet och läkemedelsresistens i cellulära reservoarer; 2- Karakterisera immunaktivering/inflammation hos ungdomar som är vertikalt infekterade med HIV-1; 3- Utvärdera storleken på HIV-reservoaren; 4- Utvärdera effekten av antiretroviral terapi och immunsvar på den virala reservoarprofilen.

Material och metoder Studiedesign Vi planerar att genomföra en observations- och jämförande studie bland ungdomar som lever med hiv och får ART i Kamerun. Deltagarna kommer att väljas ut och registreras från en befintlig kohort av nära 300 vertikalt infekterade ungdomar som rekryterats för EDCTP-READY-studien.

Huvudsyftet med EDCTP-READY-studien var att utvärdera behandlingssvar, läkemedelsresistens och HIV-1-variabilitet bland ungdomar på första och andra linjens antiretroviral behandling i Kamerun (7). I denna studie rekryterade vi 296 HIV+-ungdomar och jämförde HIV-1-genotypprofilen i cirkulerande RNA. Av 30 % (89/296) APHI som upplever virologiskt misslyckande (VL>1000 kopior/ml).

Testmetod:

Blodprover kommer att samlas in från deltagare i EDCTP-READY-studien enligt behörighetskriterierna.

Urvalskriterier:

Inklusionskriterier: Kommer att registreras i studien, HIV+-ungdomar i åldrarna 10-19 år, vertikalt infekterade, har varit på ART i minst 12 månader, som ger sitt skriftliga samtycke och vars vårdnadshavare ger skriftligt fullmaktssamtycke.

Icke-inklusionskriterier: Kommer inte att övervägas för inskrivning, HIV+-ungdom med ofullständig ART-historia, HBV/HCV- och malariasaminfektioner.

Uteslutningskriterier: Kommer att anses utesluten från studien, varje deltagare som bestämmer sig för att fritt dra sig ur efter att ha gett sitt samtycke eller inte kunnat ge blodprov.

Provstorlek: Minsta urvalsstorlek (N) för studien är 90 deltagare, beräknat utifrån följande formel: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 per arm (arm-A: VL<40 kopior/ml; arm-B: VL 40-999 kopior/ml; arm-C: virusmängd ≥1000 kopior/ml). P är prevalensen av ungdomar som lever med hiv i Kamerun med P=2% [3]; α är risken överensstämmer med α = 5 %; Za är det lilla gapet med Za = 1,96.

OBS: En grupp på 30 HIV-negativa ungdomar kommer att fungera som kontroll för immunologisk profilering.

Alla deltagare kommer att tilldelas ett nytt identifikationsnummer och data kommer att centraliseras i en lösenordsskyddad dator vid det internationella referenscentret Chantal Biya (CIRCB) för forskning om förebyggande och hantering av hiv/aids.

Studieprocedurer och variabler Procedurer och tidslinjer Denna studie kräver 18 månader för att slutföras: 3 månader (månad 1-3) för administration och etikgodkännande, 12 månader (månad 4 till 15) för inskrivning av deltagare, provtagning och laboratorieanalyser, 3 månader (månad 16 till 18) för databehandling och rapportering, se Gantt-diagram för mer information.

Baserat på inklusionskriterier kommer fallrapportformulär för HIV+-ungdomar att väljas från EDCTP-READY-studien och deras vårdnadshavare kommer att kontaktas. Samtycke och fullmaktsinformerat samtycke kommer att erhållas från ungdomar respektive vårdnadshavare. Sociodemografiska, kliniska data och ART-historia kommer att bedömas igen för perioden under inskrivningen i EDCTP-READY-studien. Då kommer 90 eller fler HIV+-ungdomar [30 per arm (arm-A: VL<40 kopior/ml; arm-B: VL 40-999 kopior/ml; arm-C: virusmängd ≥1000 kopior/ml)] att registreras . En grupp på 30 HIV-negativa ungdomar kommer att registreras för att fungera som kontroll för immunologisk profilering. Intravenöst blod (5 ml x 2) kommer att samlas in av en utbildad phlebotomist för laboratorieanalyser inklusive PBMC-isolering, plasma- och buffy coat-isolering, CD4/CD8-tal, plasmatisk virusbelastning (PVL), immunaktivering/inflammatoriska markörer bedömning, HIV-RNA och HIV-DNA genotypning, kvantifiering av virala reservoarer.

HIV-negativa deltagare kommer att rekryteras vid CIRCB, denna institution är ett referenscentrum för hantering av HIV-infekterade individer sedan 2006, och är som sådan ett känt referenscentrum för HIV-testning. Baserat på denna fördel organiserar CIRCB gratis HIV/HBV/HCV-screeningtest för flera institutioner och samhällen per år, därför kommer en liknande gratis testkampanj att organiseras i en närliggande gymnasieskola och den aktuella studien kommer att presenteras för dem som uppfyller inklusionskriterierna . Potentiella deltagare kommer att bjudas in till CIRCB med sin vårdnadshavare för registrering.

Prover kommer endast att samlas in en gång vid registreringen samt alla relevanta sociodemografiska och kliniska data. Prover kommer att transporteras till CIRCB samma dag för PBMC-isolering, DNA-, plasma- och buffy coat-isolering, CD4/CD8-räkningar och bedömning av aktiverings-/inflammatoriska markörer med flödescytometri. Plasma kommer att samlas in och lagras vid -80oC för plasmatisk viral belastning (PVL), genotypning, immunaktivering/inflammatoriska markörer bedömning med hjälp av ELISA-tester (eller flödescytometri). HIV-DNA kommer därefter att extraheras från PBMC och lagras vid -80oC; HIV-DNA kommer att skickas var tredje månad till avdelningen för experimentell medicin, University of Rome Tor Vergata, Rom, Italien, för kvantifiering av HIV-virusreservoar (se samarbetsbrev i bilagan).

Laboratorieprocedurer CD4/CD8-antal: CD4/CD8-mätningar kommer att bestämmas med en flödescytometrimaskin som tidigare beskrivits (37).

Plasma viral belastning: Plasma viral belastning kommer att bestämmas med hjälp av m 2000rt Abbott realtidssystem som tidigare beskrivits (38).

HIV-RNA-extraktion: ARN kommer att extraheras från plasmaprover med Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) enligt beskrivningen av tillverkaren.

Pro-viral DNA-extraktion från buffy coat: Pro-viral DNA kommer att extraheras med DNeasy blod- och vävnadsextraktionskit (Qiagen) enligt beskrivningen av tillverkaren.

PBMC-isolering: PBMC:er kommer att isoleras genom densitetsgradientcentrifugering med Ficoll med hjälp av ett internt protokoll.

HIV-DNA-extraktion från PBMC:er: HIV-DNA kommer att extraheras med QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) enligt beskrivningen av tillverkaren.

HIV-1 gener amplifiering och sekvensering: Sanger Sequencing för HIV-1 läkemedelsresistenstestning kommer att utföras för ungdomar som upplever virologiskt misslyckande ett internt protokoll, som tidigare beskrivits av vår forskargrupp(39). DNA-sekvenser för omvänt transkriptas kommer att analyseras för läkemedelsresistensmutationer med hjälp av Stanford Universitys databas genotypisk resistenstolkningsalgoritm (www.stanford.edu).

Fylogenetisk analys: Grannsammanfogande fylogenetiska träd kommer att skapas med hjälp av MEGA-mjukvara (Kimura 2-parametermodell, 200 bootstrap-replikationer) och FigTree (40, 41).

Immunprofilering: Både immunaktiverings-/inflammatoriska cytokiner (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 och TNF-alfa) kommer att bedömas med hjälp av kommersiella ELISA-kit och flödescytometri.

Kvantifiering av HIV-virala reservoarer: virala reservoarer kommer att kvantifieras med användning av droplet digital PCR (ddPCR) som tidigare beskrivits. Notera att denna kvantifiering kommer att utföras vid avdelningen för experimentell medicin, University of Rome Tor Vergata, Rom, Italien, som anges i samarbetsbrevet som finns i bilagan till detta förslag. En materialöverföring och ett datadelningsavtal kommer att undertecknas mellan CIRCB och UTV innan provleverans till UTV. Det är ett internt protokoll för HIV-1 B-subtyp och kommer att justeras för HIV-1 icke-B-subtyper som förväntas från kamerunska prover.

Dataanalys Data som samlas in under studien kommer att analyseras med SPSS-programvara. Associerade faktorer kommer att utvärderas med multivariat logistisk regression, med en uppskattningsmetod för den opartiska effekten av olika parametrar. Uppgifterna kommer att rapporteras som median. Icke-parametriska tester kommer att användas för data som inte är normalfördelade, jämförelser av medianer mellan olika grupper (virologisk framgång vs virologisk misslyckande) kommer att utföras med U-Mann-Whitney-testet. Korrelationer kommer att göras med Spearman-testet och p-värden mindre än 0,05 kommer att anses vara statistiskt signifikanta.

Etiska överväganden Denna studie kommer att genomföras i enlighet med Helsingforsdeklarationen om etiska principer för medicinsk forskning som involverar människor. Etiskt tillstånd kommer att erhållas från Kameruns nationella etiska kommitté för forskning om människors hälsa. efter ett informerat meddelande om studien kommer en skriftlig fullmakt att erhållas från vårdnadshavare, och ett skriftligt medgivande kommer också att erhållas från den deltagande HIV+-ungdomen, utan något tvång. Sekretess och konfidentialitet kommer att säkerställas genom användning av unika identifierare och en lösenordsskyddad databas och kommer endast att nås av behörig personal. Deltagarna kommer att vara fria att medvetet lämna studien när som helst, utan att det påverkar deras rutinmässiga övervakning på studiekliniken. Flebotomi kommer att vara icke-invasiv (venpunktur) och kommer att utföras av en utbildad sjuksköterska.

Kvalitetssäkring:

Vårt studieteam kommer att inkludera en kvalitetssäkringsansvarig som kommer att ansvara för alla SOP för studieprotokollet och kommer att hantera kompetenstestning och datavalidering under hela studien.

Hantering av potentiella risker: Riskerna för patienterna är minimala eftersom den enda procedur som volontären utsätts för är venpunktion av en flebotomist eller läkare. Venpunktionen kan vara lätt smärtsam men är praktiskt taget utan risk för komplikationer. De potentiella riskerna för försökspersoner, av vilka ingen sannolikt kommer att inträffa, kan innefatta tillfällig smärta, blåmärken på platsen eller möjlig (men extremt osannolik) infektion. Om sådana komplikationer uppstår kommer deltagaren att ges akut medicinsk behandling.