新たに修復された単一インプラントのプロテオミクス分析

研究対象者 2018年12月から2019年11月までに、以前に歯周病の治療を受け、インプラント治療を受けた、全身的に健康な非喫煙者計10名が募集されました。 各被験者は、機能負荷（ベースライン、T0）から 2 ～ 4 週間後に新たに修復されたネジ固定型インプラントを装着し、12 か月間（T1）にわたって綿密に追跡調査されました。 すべての研究インプラントはプラットフォーム スイッチ式でした (ø4.1. Straumann® Bone Level) は、2 段階の外科的配置プロトコルに従って設置されました。 同じ顎の反対側の象限にある反対側の歯を対照として使用しました。 インプラントの埋入は臨床評価とコーンビームコンピュータ断層撮影評価に基づいて計画され、補綴ガイドを使用して実施されました。 インプラントは浸漬され、6 か月後にフィクスチャー上で治癒アバットメントが調整されたときに露出し、その後 1 か月後にスクリュー固定式クラウンが調整されました。 除外基準には、18歳未満、歯が18本未満（第三大臼歯を除く）、未治療の歯周病、ステージIII～IVの歯周炎、他のインプラント部位におけるインプラント周囲炎の証拠（Berglundh et al、2018）、重大な軟部組織の病理が含まれる。 、未治療の虫歯（5つ以上）、薬剤の摂取を必要とする全身疾患、外科的インプラント埋入を禁忌とする病状、骨代謝を妨げる薬剤の投与、妊娠または授乳、外科手術時の歯槽堤または移植骨の寸法が不適切研究の 3 か月前に抜歯、喫煙。

臨床評価 部位特異的および口全体の臨床指標を T0 および T1 で評価しました。 手用歯ブラシと修正バス技術を使用した口腔衛生指導が、12 か月の研究期間中の 4 つの時点 (T0、3 か月、6 か月、および T1) で繰り返し行われました。 歯肉縁上の超音波デブリドマンとラバーカップによる研磨を含む予防処置を同時点で実施した。 詳細には、ポケットの深さ（PPD）、臨床付着レベル（CAL）、退縮（REC）、修正歯肉指数（MGI）を調査する以下の部位特異的臨床指標（スコア範囲 0 ～ 4）（Lobene et al. 1986）、修正歯垢指数 (mPI)1 (スコア範囲: 0 ～ 3) および修正歯溝出血指数 (mBI)1 (スコア範囲: 0 ～ 3) は、PPD と同様の方法で研究インプラントの近心頬側部位で測定されました。 、CAL、REC、MGI、対照歯部位におけるプラークインデックス（PI）2（スコア範囲：0～3）および歯肉溝出血インデックス（SBI）3（スコア範囲：0～5）。 角化組織の幅（KTW）は、試験インプラント/対照歯の頬側中央部で測定されました。 さらに、口全体ベースで、PPD、CAL、二分性歯肉縁上歯垢 (PI) (O'Leary et al., 1972) およびプロービング時出血 (BOP) (Ainamo et al., 1975) が 1 件あたり 6 か所で記録されました。口内に存在する歯/インプラント。 歯周病の臨床指標は、手動歯周病プローブ (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW、Hu-Friedy、シカゴ、イリノイ州、米国) を使用して最も近いミリメートルまで測定されました。

X線検査 VixWin™ Platinum Gendex ソフトウェア (米国ペンシルベニア州ハットフィールド) は、口腔内デジタル上の T0 および T1 でインプラント プラットフォームとインプラント フィクスチャーの長軸に平行な骨頂 (I-BC) の間の距離を直線的に評価しました。レントゲン写真。 根尖周囲デジタル X 線写真 (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A.、パリ、フランス) は、X 線ヘッドとデジタル センサーの間の 10 cm の距離でロングコーン平行法を使用して取得されました。

溝間液サンプルの収集 インプラント周囲溝間液（PICF）は、新たに修復された研究用インプラントの近心頬側部位から収集され、歯肉溝間液（GCF）は、T0 の対側の対照歯の近心頬側部位から収集されました。そしてT1。 PICF/GCF を収集する前に、表面を穏やかに風乾し、綿ロールを置き、唾液排出装置を使用して唾液から隔離しました。 次に、歯肉縁上のプラークを滅菌キュレットで慎重に除去し、紙ストリップ (Periopaper、OraFlow Inc.、米国ニューヨーク州スミスタウン) をインプラント周囲/歯肉溝の近心面に、軽い抵抗を感じるまで静かに置き、30 分間保持しました。秒 ストリップを配置する際に機械的外傷を避けるように注意し、血液で汚染されたストリップは廃棄した。 さらに処理するまで、ストリップをエッペンドルフチューブ（エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）内で−８０℃で保管した。

溝部液サンプルのプロテオミクス分析 (PICF/GCF) 研究インプラント部位 (n=10) と対照歯部位 (n=10) からそれぞれ T0 と T1 で収集した PICF サンプルと GCF サンプルをプールし、プロテオミクス分析に使用しました。 。 簡単に説明すると、PreOmics の SP3-iST (PreOmics GmbH) を使用したシングルポット固相強化サンプル前処理 (SP3) 支援タンパク質消化により、プールされたサンプルあたり 20 µg の総タンパク質が還元、アルキル化、トリプシン処理され、精製されました。タンパク質の抽出と消化のための製造プロトコル。 これらの抽出物は、Speedvac (Thermo Savant SPD121P、Thermo Scientific、Waltham、MA、USA) を使用して濃縮し、さらに使用するまで -20 °C で保存しました。

消化されたサンプルは、最初に 0.1% ギ酸中の 3% アセトニトリル (ACN) 30 µL で再構成され、プロテオミクスのために Easy nano-flow HPLC システム (Thermo Fisher Scientific) に接続された Fusion Orbitrap Lumos 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) に供されました。分析。 プロテオミクス分析中、アセトニトリルと水の 3 直線勾配を 0.1% ギ酸とともに 300 nL/分の流速で使用しました。 勾配は 60 分間で 2% から 30% アセトニトリルに進み、次に 10 分間で 30% から 97% アセトニトリルに進み、最後に 97% アセトニトリルで 10 分間維持されました。 質量分析計はデータに応じて動作するように設定されており、Thermo Fisher Scientific の Xcalibur ソフトウェア パッケージを使用して MS と MS/MS が自動的に切り替わります。 Orbitrap アナライザーには 300 ～ 1500 m/z の質量範囲が選択されました。

取得した MS データは Mascot (バージョン 2.4.1、 Matrix Science) 検索エンジンを使用して、10,125,458 件のエントリを含む社内データベースを検索します。これには、ヒト (Uniprot から 2022 年 2 月 22 日にアクセス) および細菌 (eHOMD から 2022 年 2 月 22 日にアクセス) タンパク質、一般的な MS 汚染物質、および逆配列を推定するための逆配列が含まれます。誤検出率。 プロテオミクス分析中、プリカーサーイオン許容値とフラグメントイオン許容値はそれぞれ 10 ppm と ±0.6 Da に設定されました。 トリプシン消化では、ペプチドあたり最大 2 回の切断ミスが許容されました。 システインのカルバミドメチル化修飾は固定修飾として選択され、アスパラギンとグルタミンの脱アミド化およびメチオニンの酸化は可変修飾パラメーターとして選択されました。

検索結果のスペクトル レポートは、Scaffold ソフトウェア (バージョン 4.2.1、Proteome ソフトウェア) を使用して生成され、1% の FDR を持つタンパク質、0.1% のペプチド FDR として特定された最小限の 2 つの固有のペプチドが、相対的なタンパク質存在量分析に使用されました。 存在量強度の変化倍数は、R ソフトウェア (R: 統計コンピューティングのための言語と環境、R 開発コア チーム) を使用して、連続する時点のペア間の値 log2 倍変化 (FC) に基づいて計算されました。 2 つの条件間での固有スペクトル数の log2FC ≥ 1 を持つタンパク質、または 1 つの条件で排他的に同定されたタンパク質は、規制されているとみなされました。

調節されたタンパク質のバイオインフォマティクス分析 WebGestalt オンライン ツールを使用して、調節されたタンパク質を Hallmark データベースに対して過剰表現分析 (ORA) にかけました。 2022年3月25日に実施されたこの分析は、T0条件とT1条件の間で歯とインプラントのタンパク質の制御を比較することを目的としていました。 同様に、2022 年 3 月 29 日の分析では、T0 または T1 条件下での歯とインプラントの両方のタンパク質の制御が検査されました。 超幾何分布を使用して p 値によってランク付けされた上位 10 件の強化された結果が報告されました。 ただし、p 値 < 0.05 の経路のみが規制されているとみなされました。