Proteomisk analyse af nyligt restaurerede enkeltimplantater

Undersøgelsespopulation I alt 10 systemisk sunde ikke-rygere, som tidligere blev behandlet for paradentose og modtog implantatbehandling, blev rekrutteret mellem december 2018 og november 2019. Hvert forsøgsperson bidrog med et nyligt restaureret skruebeholdt implantat 2-4 uger efter funktionel belastning (baseline, T0) og blev fulgt tæt over 12 måneder (T1). Alle undersøgelsesimplantater blev platformsskiftet (ø4,1. Straumann® Bone Level) og blev installeret efter en to-trins kirurgisk anbringelsesprotokol. En kontralateral tand i samme kæbe, men i den modsatte kvadrant, fungerede som kontrol. Implantatplacering blev planlagt baseret på kliniske og keglestrålecomputeriserede tomografievalueringer og blev udført ved hjælp af en proteseguide. Implantater blev nedsænket og blev blotlagt 6 måneder senere, da et helende abutment blev justeret på fiksturen efterfulgt af en skruefastholdt krone 1 måned senere. Eksklusionskriterier omfattede yngre end 18 år, <18 tænder (eksklusive tredje kindtænder), ubehandlet paradentose, paradentose trin III-IV, tegn på peri-implantitis (Berglundh et al, 2018) på andre implantationssteder, signifikant bløddelspatologi , ubehandlede karieshuler (fem eller flere), systemiske sygdomme, der kræver indtagelse af medicin, medicinske tilstande, der kontraindiceret kirurgisk implantatplacering, medicin, der interfererer med knoglemetabolisme, graviditet eller amning, utilstrækkelige dimensioner af den alveolære højderyg eller transplanteret knogle ved operationen sted og tandudtrækning 3 måneder før undersøgelsen, rygning.

Kliniske vurderinger Stedspecifikke og kliniske indekser for fuld mund blev vurderet ved T0 og T1. Mundhygiejneinstruktioner ved hjælp af en manuel tandbørste og den modificerede Bass-teknik blev gentaget på fire tidspunkter over den 12-måneders undersøgelsesperiode (T0, 3-, 6-måneder og T1). Profylakse omfattende supragingival ultralydsdebridering og polering med en gummikop blev udført på samme tidspunkter. I detaljer, de følgende stedspecifikke kliniske indekser, der sonderer lommedybde (PPD), kliniske tilknytningsniveauer (CAL), recession (REC), modificeret gingivalindeks (MGI) (scoreområde 0-4) (Lobene et al. 1986), modificeret tandplakindeks (mPI)1 (scoreområde: 0-3) og modificeret sulcus blødningsindeks (mBI)1 (scoreområde: 0-3) blev bestemt på det mesiale bukkale sted af undersøgelsesimplantatet på samme måde som PPD , CAL, REC, MGI, plakindeks (PI)2 (scoreområde: 0-3) og sulcus blødningsindeks (SBI)3 (scoreområde: 0-5) på kontroltandstedet. Bredden af ​​keratiniseret væv (KTW) blev bestemt ved det midterste bukkale aspekt af test-implantat/kontroltanden. Desuden blev PPD, CAL og dikotom supragingival tandplak (PI) (O'Leary et al., 1972) og blødning ved sondering (BOP) (Ainamo et al., 1975) registreret på seks steder pr. tand/implantat til stede i munden. Periodontale kliniske indekser blev bestemt under anvendelse af en manuel parodontal probe (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) til nærmeste millimeter.

Radiografisk undersøgelse VixWin™ Platinum Gendex-softwaren (Hatfield, PA, USA) vurderede lineært afstanden mellem implantatplatformen og knoglekammen (I-BC) parallelt med den lange akse af implantatfiksturen ved T0 og T1 på intra-oral digital røntgenbilleder. Periapikale digitale røntgenbilleder (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, Frankrig) blev opnået ved anvendelse af den lange kegle paralleliseringsteknik i en 10 cm afstand mellem røntgenhovedet og den digitale sensor.

Indsamling af crevikulær væskeprøver Peri-implantat crevikulær væske (PICF) blev opsamlet fra det mesial-bukkale sted af det nyligt restaurerede undersøgelsesimplantat, mens gingival crevikulært væske (GCF) blev opsamlet fra det mesial-bukkale sted af en kontralateral kontroltand ved T0 og T1. Før PICF/GCF-indsamling blev overfladerne forsigtigt lufttørret og isoleret fra spyt ved at placere bomuldsruller og bruge en spytudkaster. Derefter blev supragingival plak forsigtigt fjernet med sterile curetter, og papirstrimler (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) blev forsigtigt anbragt i det mesiale aspekt af peri-implantat/gingival sulcus, indtil mild modstand blev mærket og holdt i 30 sek. Der blev sørget for at undgå mekanisk traume ved placering af strimlerne, og de strimler, der var forurenet med blod, blev kasseret. Strimlerne blev opbevaret i Eppendorf-rør (Eppendorf, Hamborg, Tyskland) ved -80°C indtil videre bearbejdelse.

Proteomisk analyse af crevikulære væskeprøver (PICF/GCF) PICF- og GCF-prøverne indsamlet fra undersøgelsens implantatsteder (n=10) og kontroltandstederne (n=10), henholdsvis ved T0 og T1, blev samlet og brugt til proteomisk analyse . Kort fortalt blev 20 µg totalt protein pr. samlet prøve reduceret, alkyleret, trypsiniseret og oprenset med single-pot, fast-fase-forstærket prøvepræparation (SP3) assisteret proteinfordøjelse ved hjælp af PreOmics' SP3-iST (PreOmics GmbH) følgende fremstillingsprotokollen for proteinekstraktion og fordøjelse. Disse ekstrakter blev koncentreret under anvendelse af en Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og opbevaret ved -20 °C indtil videre brug.

De fordøjede prøver blev først rekonstitueret med 30 µL 3% acetonitril (ACN) i 0,1% myresyre og derefter underkastet Fusion Orbitrap Lumos massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) forbundet med et Easy nano-flow HPLC-system (Thermo Fisher Scientific) til proteomics analyse. Under proteomics-analyse blev en tre-liner-gradient af acetonitril og vand anvendt med 0,1 % myresyre ved en strømningshastighed på 300 nL/minut. Gradienten udviklede sig fra 2 % til 30 % acetonitril i løbet af 60 minutter, derefter fra 30 % til 97 % acetonitril på 10 minutter og holdt til sidst på 97 % acetonitril i 10 minutter. Massespektrometeret blev indstillet til at fungere på en dataafhængig måde og skiftede automatisk mellem MS og MS/MS ved hjælp af Xcalibur-softwarepakken fra Thermo Fisher Scientific. Et masseområde på 300-1500 m/z blev valgt til Orbitrap-analysatoren.

De erhvervede MS-data blev behandlet ved hjælp af Mascot (version 2.4.1, Matrix Science) søgemaskine mod en intern database indeholdende 10.125.458 poster, som inkluderede menneskelige (adgang tilgået den 22. februar 2022 fra Uniprot) og bakterielle (adgang tilgået den 22. februar 2022 fra eHOMD) proteiner, almindelige MS-kontaminanter og omvendte sekvenser til estimering af sekvenserne falsk opdagelsesrate. Under proteomics-analysen blev precursoriontolerancen og fragmentiontolerancen sat til henholdsvis 10 ppm og ±0,6 Da. Op til to glemte spaltninger pr. peptid blev tilladt til tryptisk fordøjelse. Carbamidomethyleringsmodifikationen på cystein blev valgt som en fast modifikation, mens deamidering af asparagin og glutamin og oxidation af methionin blev valgt som variable modifikationsparametre.

Spektrumrapporterne for søgeresultaterne blev genereret ved hjælp af Scaffold-software (version 4.2.1, Proteome-software), og proteiner med FDR ved 1%, minimalt 2 unikke peptider identificeret, som peptid-FDR ved 0,1% blev brugt til relativ proteinoverflodsanalyse. Foldeændringer i overflodsintensitet blev beregnet baseret på værdi log2-foldændring (FC) mellem par af på hinanden følgende tidspunkter ved brug af R-software (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Proteiner med en log2FC ≥ 1 unikke spektrumtal mellem to tilstande eller udelukkende identificeret i én tilstand blev betragtet som reguleret.

Bioinformatikanalyse for de regulerede proteiner De regulerede proteiner gennemgik overrepræsentationsanalyse (ORA) mod Hallmark-databasen ved hjælp af WebGestalt online-værktøjet. Analysen, der blev udført den 25. marts 2022, havde til formål at sammenligne reguleringen af ​​proteiner i tænder og implantater mellem T0- og T1-tilstande. På samme måde undersøgte analysen den 29. marts 2022 reguleringen af ​​proteiner i både tænder og implantater under enten T0- eller T1-betingelserne. De 10 bedste berigede resultater, rangeret efter p-værdi ved hjælp af den hypergeometriske fordeling, blev rapporteret. Imidlertid blev kun veje med en p-værdi < 0,05 betragtet som regulerede.