Analiza proteomiczna nowo odtworzonych pojedynczych implantów

Populacja badania W okresie od grudnia 2018 r. do listopada 2019 r. do badania zrekrutowano łącznie 10 zdrowych, niepalących osób, które były wcześniej leczone z powodu chorób przyzębia i otrzymały leczenie implantologiczne. Każdy pacjent wszczepił nowo odtworzony, przykręcany implant 2–4 tygodnie po obciążeniu funkcjonalnym (wartość wyjściowa, T0) i był uważnie obserwowany przez 12 miesięcy (T1). Wszystkie implanty objęte badaniem miały platformę przełączaną (ø4,1. Straumann® Bone Level) i zostały zainstalowane zgodnie z dwuetapowym protokołem umieszczania chirurgicznego. Kontrolę stanowił ząb przeciwległy w tej samej szczęce, ale w przeciwległym kwadrancie. Wszczepienie implantu zaplanowano na podstawie oceny klinicznej oraz tomografii komputerowej wiązki stożkowej i przeprowadzono przy użyciu prowadnicy protetycznej. Implanty zanurzono i odsłonięto 6 miesięcy później, kiedy na uchwycie dopasowano łącznik gojący, a po miesiącu założono koronę przykręcaną. Kryteria wykluczenia obejmowały wiek poniżej 18 lat, <18 zębów (z wyłączeniem trzecich zębów trzonowych), nieleczoną chorobę przyzębia, zapalenie przyzębia w stadium III-IV, cechy periimplantitis (Berglundh i in., 2018) w innych miejscach implantacji, znaczna patologia tkanek miękkich , nieleczona próchnica (pięć i więcej), choroby ogólnoustrojowe wymagające przyjmowania leków, stany chorobowe przeciwwskazane do chirurgicznego wszczepienia implantu, leki zaburzające metabolizm kości, ciąża lub laktacja, nieodpowiednie wymiary wyrostka zębodołowego lub przeszczepionej kości w miejscu zabiegu chirurgicznego miejscu badania oraz ekstrakcja zęba na 3 miesiące przed badaniem, palenie tytoniu.

Ocena kliniczna Wskaźniki kliniczne specyficzne dla miejsca i pełnej jamy ustnej oceniano w T0 i T1. Instrukcje dotyczące higieny jamy ustnej przy użyciu ręcznej szczoteczki do zębów i zmodyfikowanej techniki Bassa powtarzano w czterech punktach czasowych w ciągu 12-miesięcznego okresu badania (T0, 3, 6 miesięcy i T1). W tym samym czasie prowadzono profilaktykę obejmującą naddziąsłowe oczyszczanie ultradźwiękowe i polerowanie gumką. Szczegółowo, następujące specyficzne dla miejsca wskaźniki kliniczne badające głębokość kieszeni (PPD), kliniczne poziomy przyczepu (CAL), recesję (REC), zmodyfikowany wskaźnik dziąseł (MGI) (zakres punktacji 0-4) (Lobene i in. 1986), zmodyfikowany wskaźnik płytki nazębnej (mPI)1 (zakres punktacji: 0-3) i zmodyfikowany wskaźnik krwawienia z bruzdy dziąsłowej (mBI)1 (zakres punktacji: 0-3) oznaczono w mezjalnej części policzkowej badanego implantu w podobny sposób jak PPD , CAL, REC, MGI, wskaźnik płytki nazębnej (PI)2 (zakres punktacji: 0-3) i wskaźnik krwawienia z bruzdy (SBI)3 (zakres punktacji: 0-5) w miejscu zęba kontrolnego. Szerokość tkanek zrogowaciałych (KTW) określono w środkowej części policzkowej zęba badanego-implantu/kontrolnego. Co więcej, w przypadku całej jamy ustnej PPD, CAL i dychotomiczna naddziąsłowa płytka nazębna (PI) (O'Leary i in., 1972) oraz krwawienie podczas sondowania (BOP) (Ainamo i in., 1975) rejestrowano w sześciu miejscach na ząb/implant obecny w jamie ustnej. Przyzębne wskaźniki kliniczne określono za pomocą ręcznej sondy periodontologicznej (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) z dokładnością do milimetra.

Badanie radiograficzne Oprogramowanie VixWin™ Platinum Gendex (Hatfield, Pensylwania, USA) oceniało liniowo odległość pomiędzy platformą implantu a grzebieniem kości (I-BC) równolegle do długiej osi mocowania implantu w punktach T0 i T1 w badaniu wewnątrzustnym cyfrowym radiogramy. Cyfrowe zdjęcia rentgenowskie okołowierzchołkowe (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paryż, Francja) uzyskano przy użyciu techniki równoległego długiego stożka w odległości 10 cm pomiędzy głowicą rentgenowską a czujnikiem cyfrowym.

Pobieranie próbek płynu szczelinowego Płyn okołoimplantowy (PICF) pobrano z okolicy mezjalno-policzkowej nowo odtworzonego implantu badawczego, natomiast płyn dziąsłowy (GCF) pobrano z okolicy mezjalno-policzkowej przeciwnego zęba kontrolnego w punkcie T0 i T1. Przed pobraniem PICF/GCF powierzchnie delikatnie wysuszono na powietrzu i odizolowano od śliny poprzez umieszczenie wacików i użycie ślinociągu. Następnie ostrożnie usunięto płytkę naddziąsłową za pomocą sterylnych łyżeczek i paski papieru (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) delikatnie umieszczono w mezjalnej części okolicy implantu/bruzdy dziąsłowej aż do wyczucia łagodnego oporu i przytrzymano przez 30 sek. Podczas umieszczania pasków zachowano ostrożność, aby uniknąć urazów mechanicznych, a paski zanieczyszczone krwią wyrzucono. Paski przechowywano w probówkach Eppendorf (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) w temperaturze -80°C do czasu dalszej obróbki.

Analiza proteomiczna próbek płynu zębodołowego (PICF/GCF) Próbki PICF i GCF pobrane z badanych miejsc implantacji (n=10) i zębów kontrolnych (n=10), odpowiednio w T0 i T1, połączono i wykorzystano do analizy proteomicznej . W skrócie, 20 µg całkowitego białka na połączoną próbkę zredukowano, alkilowano, trypsynizowano i oczyszczano za pomocą jednonaczyniowego, wzmocnionego na fazie stałej przygotowania próbki (SP3) wspomaganego trawieniem białka przy użyciu SP3-iST firmy PreOmics (PreOmics GmbH), postępując protokół produkcyjny ekstrakcji i trawienia białek. Ekstrakty te zatężono przy użyciu Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i przechowywano w -20°C do dalszego użycia.

Strawione próbki najpierw roztworzono w 30 µl 3% acetonitrylu (ACN) w 0,1% kwasie mrówkowym, a następnie poddano spektrometrowi mas Fusion Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific) połączonemu z systemem Easy nano-flow HPLC (Thermo Fisher Scientific) do celów proteomiki analiza. Podczas analizy proteomicznej zastosowano trójliniowy gradient acetonitrylu i wody z 0,1% kwasem mrówkowym przy szybkości przepływu 300 nl/minutę. Gradient wzrastał od 2% do 30% acetonitrylu w ciągu 60 minut, następnie od 30% do 97% acetonitrylu w ciągu 10 minut i ostatecznie utrzymywał się na poziomie 97% acetonitrylu przez 10 minut. Spektrometr mas ustawiono tak, aby działał w sposób zależny od danych, automatycznie przełączając się między MS i MS/MS przy użyciu pakietu oprogramowania Xcalibur firmy Thermo Fisher Scientific. Dla analizatora Orbitrap wybrano zakres mas 300-1500 m/z.

Pozyskane dane MS zostały przetworzone przy użyciu programu Mascot (wersja 2.4.1, Matrix Science) w oparciu o wewnętrzną bazę danych zawierającą 10 125 458 wpisów, która obejmowała białka ludzkie (dostęp: 22 lutego 2022 r. z Uniprot) i bakteryjne (dostęp: 22 lutego 2022 r. z eHOMD), typowe zanieczyszczenia MS i odwrotne sekwencje do szacowania współczynnik fałszywych odkryć. Podczas analizy proteomicznej tolerancję jonów prekursorowych i tolerancję jonów fragmentacyjnych ustawiono odpowiednio na 10 ppm i ± 0,6 Da. Do trawienia trypsyną dopuszczano maksymalnie dwa pominięte cięcia na peptyd. Jako modyfikację stałą wybrano modyfikację karbamidometylacji cysteiny, natomiast jako zmienne parametry modyfikacji wybrano deamidację asparaginy i glutaminy oraz utlenianie metioniny.

Raporty widma wyników wyszukiwania wygenerowano przy użyciu oprogramowania Scaffold (wersja 4.2.1, oprogramowanie Proteome), a białka z FDR na poziomie 1%, zidentyfikowano co najmniej 2 unikalne peptydy, ponieważ peptyd FDR na poziomie 0,1% zastosowano do analizy względnej obfitości białka. Krotność zmian intensywności obfitości obliczono w oparciu o wartość log2-krotności zmiany (FC) pomiędzy parami kolejnych punktów czasowych przy użyciu oprogramowania R (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Białka z log2FC ≥ 1 unikalnych zliczeń widm między dwoma stanami lub zidentyfikowane wyłącznie w jednym stanie uznano za regulowane.

Analiza bioinformatyczna białek regulowanych Białka regulowane poddano analizie nadreprezentacji (ORA) w stosunku do bazy danych Hallmark przy użyciu narzędzia internetowego WebGestalt. Analiza przeprowadzona 25 marca 2022 roku miała na celu porównanie regulacji białek w zębach i implantach pomiędzy warunkami T0 i T1. Podobnie 29 marca 2022 r. w analizie zbadano regulację białek zarówno w zębach, jak i implantach w warunkach T0 lub T1. Zgłoszono 10 najlepszych wzbogaconych wyników, uszeregowanych według wartości p przy użyciu rozkładu hipergeometrycznego. Jednakże jedynie ścieżki z wartością p < 0,05 uznano za regulowane.