Análise proteômica de implantes individuais recentemente restaurados

População do estudo Um total de 10 não fumantes sistemicamente saudáveis, que foram previamente tratados para doença periodontal e receberam terapia com implantes, foram recrutados entre dezembro de 2018 e novembro de 2019. Cada sujeito contribuiu com um implante aparafusado recém-restaurado 2 a 4 semanas após a carga funcional (linha de base, T0) e foi acompanhado de perto durante 12 meses (T1). Todos os implantes do estudo foram trocados de plataforma (ø4.1. Straumann® Bone Level) e foram instalados seguindo um protocolo de colocação cirúrgica em dois estágios. Um dente contralateral na mesma mandíbula, mas no quadrante oposto, serviu como controle. A colocação do implante foi planejada com base em avaliações clínicas e de tomografia computadorizada de feixe cônico e foi realizada com guia protético. Os implantes foram submersos e expostos 6 meses depois, quando um pilar de cicatrização foi ajustado no acessório, seguido por uma coroa aparafusada 1 mês depois. Os critérios de exclusão incluíram idade inferior a 18 anos, <18 dentes (excluindo terceiros molares), doença periodontal não tratada, periodontite em estágio III-IV, evidência de peri-implantite (Berglundh et al, 2018) em outros locais de implante, patologia significativa de tecidos moles , cáries não tratadas (cinco ou mais), doenças sistêmicas que requerem ingestão de medicamentos, condições médicas que contraindicam a colocação de implantes cirúrgicos, medicação que interfere no metabolismo ósseo, gravidez ou lactação, dimensões inadequadas do rebordo alveolar ou osso enxertado no local cirúrgico local e extração dentária 3 meses antes do estudo, fumar.

Avaliações clínicas Os índices clínicos específicos do local e de boca inteira foram avaliados em T0 e T1. As instruções de higiene bucal usando escova de dentes manual e a técnica de Bass modificada foram reiteradas em quatro momentos durante o período de estudo de 12 meses (T0, 3, 6 meses e T1). A profilaxia com desbridamento ultrassônico supragengival e polimento com copo de borracha foi realizada nos mesmos momentos. Em detalhes, os seguintes índices clínicos específicos do local que sondam a profundidade da bolsa (PPD), níveis clínicos de inserção (CAL), recessão (REC), índice gengival modificado (MGI) (faixa de pontuação 0-4) (Lobene et al. 1986), índice de placa dentária modificado (mPI)1 (intervalo de pontuação: 0-3) e índice de sangramento no sulco modificado (mBI)1 (intervalo de pontuação: 0-3) foram determinados no local mesial bucal do implante do estudo de maneira semelhante ao PPD , CAL, REC, MGI, índice de placa (PI)2 (intervalo de pontuação: 0-3) e índice de sangramento no sulco (SBI)3 (intervalo de pontuação: 0-5) no local do dente de controle. A largura dos tecidos queratinizados (KTW) foi determinada na face médio-vestibular do dente teste-implante/controle. Além disso, em boca inteira PPD, CAL e placa dentária supragengival dicotômica (PI) (O'Leary et al., 1972) e sangramento à sondagem (BOP) (Ainamo et al., 1975) foram registrados em seis locais por dente/implante presente na boca. Os índices clínicos periodontais foram determinados usando uma sonda periodontal manual (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA) até o milímetro mais próximo.

Exame radiográfico O software VixWin™ Platinum Gendex (Hatfield, PA, EUA) avaliou linearmente a distância entre a plataforma do implante e a crista óssea (I-BC) paralelamente ao longo eixo da fixação do implante em T0 e T1 em imagens digitais intra-orais. radiografias. Radiografias digitais periapicais (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, França) foram obtidas pela técnica de paralelo de cone longo a uma distância de 10 cm entre a cabeça do raio X e o sensor digital.

Coleta de amostras de fluido crevicular O fluido crevicular peri-implantar (PICF) foi coletado do local mésio-vestibular do implante de estudo recém-restaurado, enquanto o fluido crevicular gengival (GCF) foi coletado do local mésio-vestibular de um dente de controle contralateral em T0 e T1. Antes da coleta do PICF/GCF, as superfícies foram suavemente secas ao ar e isoladas da saliva através da colocação de rolos de algodão e do uso de um ejetor de saliva. Em seguida, a placa supragengival foi cuidadosamente removida com curetas estéreis e tiras de papel (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, EUA) foram suavemente colocadas na face mesial do sulco peri-implantar/gengival até sentir leve resistência e mantidas por 30 minutos. seg. Tomou-se cuidado para evitar traumas mecânicos na colocação das tiras e as tiras contaminadas com sangue foram descartadas. As tiras foram armazenadas em tubos Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) a -80°C até serem processadas posteriormente.

Análise proteômica de amostras de fluido crevicular (PICF/GCF) As amostras de PICF e GCF coletadas dos locais de implante de estudo (n=10) e dos locais de dente de controle (n=10), respectivamente em T0 e T1 foram agrupadas e usadas para análise proteômica . Resumidamente, 20 µg de proteína total por amostra reunida foram reduzidos, alquilados, tripsinizados e purificados com digestão de proteína assistida por preparação de amostra aprimorada em fase sólida (SP3) de vaso único usando SP3-iST da PreOmics (PreOmics GmbH) seguindo o protocolo de fabricação para extração e digestão de proteínas. Esses extratos foram concentrados usando um Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e armazenados a -20 °C até uso posterior.

As amostras digeridas foram primeiro reconstituídas com 30 µL de acetonitrila a 3% (ACN) em ácido fórmico a 0,1% e depois submetidas ao espectrômetro de massa Fusion Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific) em interface com um sistema HPLC Easy nano-flow (Thermo Fisher Scientific) para proteômica análise. Durante a análise proteômica, um gradiente de três linhas de acetonitrila e água foi utilizado com ácido fórmico a 0,1% a uma vazão de 300 nL/minuto. O gradiente progrediu de 2% para 30% de acetonitrila ao longo de 60 minutos, depois de 30% para 97% de acetonitrila em 10 minutos e finalmente mantido em 97% de acetonitrila por 10 minutos. O espectrômetro de massa foi configurado para operar de maneira dependente de dados, alternando automaticamente entre MS e MS/MS usando o pacote de software Xcalibur da Thermo Fisher Scientific. Uma faixa de massa de 300-1500 m/z foi selecionada para o analisador Orbitrap.

Os dados MS adquiridos foram processados ​​usando o Mascot (versão 2.4.1, Matrix Science) em um banco de dados interno contendo 10.125.458 entradas, que incluíam proteínas humanas (acessadas em 22 de fevereiro de 2022 pelo Uniprot) e bacterianas (acessadas em 22 de fevereiro de 2022 pelo eHOMD), contaminantes comuns de MS e sequências reversas para estimar o taxa de descoberta falsa. Durante a análise proteômica, a tolerância ao íon precursor e a tolerância ao íon fragmento foram ajustadas para 10 ppm e ±0,6 Da, respectivamente. Foram permitidas até duas clivagens perdidas por peptídeo para digestão tríptica. A modificação da carbamidometilação na cisteína foi selecionada como uma modificação fixa, enquanto a desamidação da asparagina e da glutamina e a oxidação da metionina foram escolhidas como parâmetros de modificação variáveis.

Os relatórios de espectro dos resultados da pesquisa foram gerados usando o software Scaffold (versão 4.2.1, software Proteome) e proteínas com FDR a 1%, mínimo de 2 peptídeos únicos identificados, já que o peptídeo FDR a 0,1% foi usado para análise de abundância relativa de proteínas. As mudanças de dobra na intensidade de abundância foram calculadas com base no valor log2 da mudança de dobra (FC) entre pares de pontos de tempo consecutivos usando software R (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Proteínas com log2FC ≥ 1 de contagens de espectro único entre duas condições ou identificadas exclusivamente em uma condição foram consideradas reguladas.

Análise bioinformática para as proteínas reguladas As proteínas reguladas foram submetidas à análise de sobre-representação (ORA) no banco de dados Hallmark usando a ferramenta online WebGestalt. A análise, realizada em 25 de março de 2022, teve como objetivo comparar a regulação de proteínas em dentes e implantes entre as condições T0 e T1. Da mesma forma, em 29 de março de 2022, a análise examinou a regulação de proteínas tanto em dentes quanto em implantes nas condições T0 ou T1. Os 10 principais resultados enriquecidos, classificados por valor p usando a distribuição hipergeométrica, foram relatados. No entanto, apenas as vias com valor de p < 0,05 foram consideradas regulamentadas.