Újonnan helyreállított egyszeri implantátumok proteomikai elemzése

Vizsgálati populáció Összesen 10 szisztémásan egészséges nemdohányzót vettek fel 2018 decembere és 2019 novembere között, akiket korábban parodontális betegséggel kezeltek és implantációs kezelésben részesültek. Mindegyik alany egy újonnan helyreállított csavarral rögzített implantátummal járult hozzá 2-4 héttel a funkcionális terhelés után (alapvonal, T0), és 12 hónapon keresztül szorosan követték őket (T1). Minden vizsgálati implantátum platformkapcsolós volt (ø4.1. Straumann® Bone Level) és kétlépcsős műtéti elhelyezési protokollt követve telepítették. Kontrollként egy ellenoldali fog szolgált ugyanabban az állkapocsban, de a másik kvadránsban. Az implantátum beültetése klinikai és kúpnyalábos számítógépes tomográfiás kiértékelések alapján történt, és protetikai útmutató segítségével történt. Az implantátumokat víz alá merítették, és 6 hónappal később szabaddá tettek, amikor egy gyógyító műcsonkot állítottak be a rögzítőelemen, majd egy csavarral rögzített koronát 1 hónappal később. A kizárási kritériumok közé tartozott a 18 évnél fiatalabb életkor, <18 fog (kivéve a harmadik őrlőfogakat), kezeletlen fogágybetegség, III-IV. stádiumú parodontitis, periimplantitis bizonyítéka (Berglundh et al, 2018) más beültetési helyeken, jelentős lágyrész-patológia , kezeletlen szuvas üregek (öt vagy több), gyógyszerek szedését igénylő szisztémás betegségek, műtéti implantátum beültetést ellenjavalló egészségügyi állapotok, csontanyagcserét zavaró gyógyszer, terhesség vagy szoptatás, a műtéti alveoláris gerinc vagy beültetett csont nem megfelelő méretei hely, és a vizsgálat előtt 3 hónappal foghúzás, dohányzás.

Klinikai értékelések A helyspecifikus és a teljes száj klinikai mutatóit T0 és T1 időpontban értékeltük. A kézi fogkefével és a módosított Bass technikával végzett szájhigiénés utasításokat négy időpontban ismételték meg a 12 hónapos vizsgálati időszak alatt (T0, 3, 6 hónap és T1). Ugyanabban az időpontban történt a profilaxis, amely a supragingivális ultrahangos debridement és a gumipohár polírozásból állt. Részletesen, a következő helyspecifikus klinikai indexek, amelyek a zsebmélységet (PPD), a klinikai kötődési szinteket (CAL), a recessziót (REC), a módosított ínyindexet (MGI) (0-4 ponttartomány) vizsgálják (Lobene et al. 1986), A módosított dental plaque index (mPI)1 (pontszámtartomány: 0-3) és a módosított sulcus vérzési index (mBI)1 (pontszámtartomány: 0-3) a vizsgálati implantátum mesiális bukkális helyén a PPD-hez hasonló módon történt. , CAL, REC, MGI, plakk index (PI)2 (pontszámtartomány: 0-3) és sulcus vérzési index (SBI)3 (pontszámtartomány: 0-5) a kontrollfog helyén. A keratinizált szövetek szélességét (KTW) a teszt-implantátum/kontrollfog bukkális közepén határoztuk meg. Ezen túlmenően a teljes száj alapon PPD-t, CAL-t és dichotóm supragingivális fogplakkot (PI) (O'Leary et al., 1972) és vérzést szondázáskor (BOP) (Ainamo és mtsai, 1975) rögzítettek hat helyen per fog/implantátum a szájban. A periodontális klinikai mutatókat manuális parodontális szondával (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) határoztuk meg milliméteres pontossággal.

Radiográfiai vizsgálat A VixWin™ Platinum Gendex szoftver (Hatfield, PA, USA) lineárisan értékelte az implantátum platform és a csonttaréj (I-BC) közötti távolságot az implantátum rögzítőelemének hosszú tengelyével párhuzamosan T0 és T1 pontokon intraorális digitálisan. röntgenfelvételek. A periapikális digitális röntgenfelvételeket (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Párizs, Franciaország) a röntgenfej és a digitális érzékelő közötti 10 cm-es távolságban hosszú kúp párhuzamosítási technikával készítettük.

Crevicularis folyadék minták gyűjtése Az újonnan felújított vizsgálati implantátum mesialis-bukkális helyéről a periimplantális crevicularis folyadékot (PICF), míg a kontralaterális kontroll fog meziális-bukkális helyéről gingiva crevicularis folyadékot (GCF) gyűjtöttünk T0-nál. és T1. A PICF/GCF gyűjtés előtt a felületeket óvatosan levegőn szárítottuk, és pamuttekercsek elhelyezésével és nyálszívóval izoláltuk a nyáltól. Ezután a szupragingivális plakkot steril küretekkel óvatosan eltávolítottuk, és papírcsíkokat (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) óvatosan helyeztünk a periimplantátum/gingivális barázda meziális oldalára, amíg enyhe ellenállást nem éreztünk, és 30 percig tartottuk. mp. A csíkok elhelyezésekor ügyeltek arra, hogy elkerüljék a mechanikai sérüléseket, és a vérrel szennyezett csíkokat eldobták. A csíkokat Eppendorf-csövekben (Eppendorf, Hamburg, Németország) -80 °C-on tároltuk a további feldolgozásig.

A crevicularis folyadékminták proteomikai analízise (PICF/GCF) A vizsgálati beültetés helyéről (n=10) és a kontroll fogak helyéről (n=10) gyűjtött PICF és GCF mintákat T0 és T1 időpontban összegyűjtöttük, és felhasználtuk a proteomikai elemzéshez. . Összefoglalva, egyesített mintánként 20 µg teljes fehérjét redukáltunk, alkileztünk, tripszineztünk és tisztítottunk egyedényes, szilárd fázisú, fokozott minta-előkészítéssel (SP3) támogatott fehérjeemésztéssel a PreOmics SP3-iST (PreOmics GmbH) segítségével. a fehérjekivonás és emésztés gyártási protokollja. Ezeket a kivonatokat Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével koncentráltuk, és további felhasználásig -20 °C-on tároltuk.

Az emésztett mintákat először 30 µl 3%-os acetonitril (ACN) 0,1%-os hangyasavban oldottuk fel, majd Fusion Orbitrap Lumos tömegspektrométernek (Thermo Fisher Scientific) vetettük alá, amely egy Easy nano-flow HPLC rendszerhez (Thermo Fisher Scientific) kapcsolódott proteomikai célokra. elemzés. A proteomikai analízis során acetonitril és víz háromrétegű gradiensét alkalmaztuk 0,1%-os hangyasavval 300 nl/perc áramlási sebesség mellett. A gradiens 2%-ról 30%-ra acetonitrilre lépett előre 60 perc alatt, majd 30%-ról 97%-ra acetonitrilre 10 perc alatt, végül 97%-os acetonitrilnél tartottuk 10 percig. A tömegspektrométert úgy állítottuk be, hogy adatfüggő módon működjön, automatikusan váltson MS és MS/MS között a Thermo Fisher Scientific Xcalibur szoftvercsomagjával. Az Orbitrap analizátorhoz 300-1500 m/z tömegtartományt választottunk.

A megszerzett MS-adatokat a Mascot (2.4.1-es verzió, Matrix Science) keresőmotorja egy 10 125 458 bejegyzést tartalmazó házon belüli adatbázissal szemben, amely emberi (2022. február 22-én az Uniprot-tól) és bakteriális (2022. február 22-én az eHOMD-től) fehérjéket, gyakori MS-szennyeződéseket és fordított szekvenciákat tartalmazott a becsléshez. hamis felfedezési arány. A proteomikai analízis során a prekurzor ion-toleranciát 10 ppm-re, illetve a fragmension-toleranciát ±0,6 Da-ra állítottuk be. A triptikus emésztéshez peptidenként legfeljebb két kihagyott hasítás megengedett. Fix módosításként a cisztein karbamidometilációs módosítását, míg változó módosítási paraméterekként az aszparagin és glutamin dezaminációját és a metionin oxidációját választottuk.

A keresési eredmények spektrumjelentéseit Scaffold szoftverrel (4.2.1-es verzió, Proteome szoftver) állítottuk elő, és az 1%-os FDR-t tartalmazó fehérjéket, minimum 2 egyedi peptidet azonosítottunk 0,1%-os peptid FDR-ként a relatív fehérjebőség analíziséhez. A bőség intenzitásában bekövetkező hajtásváltozásokat az egymást követő időpontok párjai közötti log2-szeres változás (FC) érték alapján számítottuk ki R-szoftver segítségével (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Szabályozottnak tekintették azokat a fehérjéket, amelyeknek log2FC ≥ 1 egyedi spektrumszáma van két állapot között, vagy amelyek kizárólag egy állapotban azonosítottak.

A szabályozott fehérjék bioinformatikai elemzése A szabályozott fehérjék felülreprezentáltsági analízisét (ORA) vetették alá a Hallmark adatbázissal a WebGestalt online eszköz segítségével. A 2022. március 25-én elvégzett elemzés célja a fehérjék szabályozásának összehasonlítása volt a fogakban és az implantátumokban a T0 és T1 állapotok között. Hasonlóképpen, 2022. március 29-én az elemzés a fehérjék szabályozását vizsgálta mind a fogakban, mind az implantátumokban T0 vagy T1 körülmények között. A 10 legjobb dúsított eredményt jelentették, amelyeket p-érték szerint rangsoroltak a hipergeometrikus eloszlás alapján. Azonban csak azokat az útvonalakat tekintettük szabályozottnak, amelyek p-értéke < 0,05.