Proteomisk analys av nyligen restaurerade enstaka implantat

Studiepopulation Totalt 10 systemiskt friska icke-rökare, som tidigare behandlats för parodontal sjukdom och fått implantatbehandling, rekryterades mellan december 2018 och november 2019. Varje försöksperson bidrog med ett nyligen återställt skruvbehållet implantat 2-4 veckor efter funktionell belastning (baslinje, T0) och följdes noga under 12 månader (T1). Alla studieimplantat var plattformsväxlade (ø4.1. Straumann® Bone Level) och installerades enligt ett tvåstegs kirurgiskt placeringsprotokoll. En kontralateral tand i samma käke, men på den motsatta kvadranten, fungerade som kontroll. Implantatplacering planerades baserat på kliniska och konstråle datoriserade tomografiutvärderingar och utfördes med hjälp av en protesguide. Implantat sänktes ned och exponerades 6 månader senare när ett läkande distans justerades på fixturen följt av en skruvförbehållen krona 1 månad senare. Uteslutningskriterier inkluderade yngre än 18 år, <18 tänder (exklusive tredje molar), obehandlad periodontal sjukdom, parodontit Steg III-IV, tecken på peri-implantit (Berglundh et al, 2018) vid andra implantatställen, signifikant mjukdelspatologi , obehandlade kariösa kaviteter (fem eller fler), systemiska sjukdomar som kräver intag av mediciner, medicinska tillstånd som kontraindicerade kirurgisk implantatplacering, medicinering som stör benmetabolismen, graviditet eller amning, otillräckliga dimensioner av alveolarryggen eller ympat ben vid operationen plats och tandutdragning 3 månader före studien, rökning.

Kliniska bedömningar Platsspecifika och helmuns kliniska index bedömdes vid T0 och T1. Munhygieninstruktioner med hjälp av en manuell tandborste och den modifierade Bass-tekniken upprepades vid fyra tidpunkter under den 12-månaders studieperioden (T0, 3-, 6-månader och T1). Profylax innefattande supragingival ultraljudsdebridering och polering med en gummikopp utfördes vid samma tidpunkter. I detalj, följande platsspecifika kliniska index som sonderar fickdjup (PPD), kliniska anknytningsnivåer (CAL), recession (REC), modifierat gingivalindex (MGI) (poängintervall 0-4) (Lobene et al. 1986), modifierat tandplackindex (mPI)1 (poängintervall: 0-3) och modifierat sulcus blödningsindex (mBI)1 (poängintervall: 0-3) bestämdes vid det mesiala buckala stället för studieimplantatet på liknande sätt som PPD , CAL, REC, MGI, plackindex (PI)2 (poängintervall: 0-3) och sulcus blödningsindex (SBI)3 (poängintervall: 0-5) vid kontrolltandstället. Bredden av keratiniserade vävnader (KTW) bestämdes vid den mitten av buckala aspekten av test-implantat/kontrolltanden. På helmunsbasis registrerades dessutom PPD, CAL och dikotom supragingivalt tandplack (PI) (O'Leary et al., 1972) och blödning vid sondering (BOP) (Ainamo et al., 1975) på sex platser per tand/implantat som finns i munnen. Parodontala kliniska index bestämdes med användning av en manuell periodontal sond (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) till närmaste millimeter.

Röntgenundersökning Programvaran VixWin™ Platinum Gendex (Hatfield, PA, USA) bedömde linjärt avståndet mellan implantatplattformen och benkammen (I-BC) parallellt med implantatfixturens långa axel vid T0 och T1 på intraoral digital röntgenbilder. Periapikala digitala röntgenbilder (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, Frankrike) erhölls med användning av den långa konen parallella tekniken på ett 10 cm avstånd mellan röntgenhuvudet och den digitala sensorn.

Insamling av crevikulära vätskeprover Peri-implantat crevikulär vätska (PICF) samlades in från det mesial-buckala stället på det nyligen återställda studieimplantatet, medan gingival crevicular fluid (GCF) samlades in från det mesial-buckala stället för en kontralateral kontrolltand vid T0 och T1. Innan PICF/GCF-insamling lufttorkades ytorna försiktigt och isolerades från saliv genom att placera bomullsrullar och använda en salivejektor. Sedan avlägsnades supragingival plack försiktigt med sterila kyretter och pappersremsor (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) placerades försiktigt i den mesiala aspekten av periimplantatet/gingivalsulcus tills mild motstånd kändes och hölls i 30 sek. Försiktighet vidtogs för att undvika mekaniska trauman när remsorna placerades och de remsor som var kontaminerade med blod kasserades. Remsorna lagrades i Eppendorf-rör (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) vid -80°C tills vidare bearbetning.

Proteomisk analys av crevikulära vätskeprover (PICF/GCF) PICF- och GCF-proverna som samlats in från studiens implantatställen (n=10) och kontrolltandställena (n=10), respektive vid T0 och T1, slogs samman och användes för proteomikanalys . I korthet reducerades 20 µg totalt protein per poolat prov, alkylerades, trypsiniserades och renades med singelkärl, fastfasförstärkt provberedning (SP3) assisterad proteinnedbrytning med användning av PreOmics SP3-iST (PreOmics GmbH) efter tillverkningsprotokollet för proteinextraktion och matsmältning. Dessa extrakt koncentrerades med användning av en Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) och lagrades vid -20 °C tills vidare användning.

De smälta proverna rekonstituerades först med 30 µL 3% acetonitril (ACN) i 0,1% myrsyra och utsattes sedan för Fusion Orbitrap Lumos masspektrometer (Thermo Fisher Scientific) kopplad till ett Easy nano-flow HPLC-system (Thermo Fisher Scientific) för proteomik analys. Under proteomikanalys användes en tre-liner-gradient av acetonitril och vatten med 0,1 % myrsyra vid en flödeshastighet av 300 nL/minut. Gradienten steg från 2 % till 30 % acetonitril under 60 minuter, sedan från 30 % till 97 % acetonitril på 10 minuter och hölls slutligen vid 97 % acetonitril under 10 minuter. Masspektrometern ställdes in för att fungera på ett databeroende sätt och växlade automatiskt mellan MS och MS/MS med hjälp av Xcalibur-programpaketet från Thermo Fisher Scientific. Ett massområde på 300-1500 m/z valdes för Orbitrap-analysatorn.

Den inhämtade MS-datan bearbetades med Mascot (version 2.4.1, Matrix Science) sökmotor mot en intern databas som innehåller 10 125 458 poster, som inkluderade mänskliga (åtkoms den 22 februari 2022 från Uniprot) och bakteriella (åtkoms den 22 februari 2022 från eHOMD) proteiner, vanliga MS-föroreningar och omvända sekvenser för att uppskatta de falsk upptäcktsfrekvens. Under proteomikanalysen sattes prekursorjontoleransen och fragmentjontoleransen till 10 ppm respektive ±0,6 Da. Upp till två missade klyvningar per peptid tilläts för tryptisk digestion. Karbamidometyleringsmodifikationen på cystein valdes som en fast modifiering, medan deamidering av asparagin och glutamin och oxidation av metionin valdes som variabla modifieringsparametrar.

Spektrumrapporterna för sökresultaten genererades med hjälp av Scaffold-mjukvara (version 4.2.1, Proteome-programvara), och proteiner med FDR vid 1%, minst 2 unika peptider identifierade, som peptid-FDR vid 0,1% användes för relativ proteinöverflödsanalys. Vikningsförändringar i överflödsintensitet beräknades baserat på värde log2 gångers förändring (FC) mellan par av på varandra följande tidpunkter med användning av R-programvara (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Proteiner med en log2FC ≥ 1 av unika spektrumräkningar mellan två tillstånd eller exklusivt identifierade i ett tillstånd ansågs reglerade.

Bioinformatikanalys för de reglerade proteinerna De reglerade proteinerna genomgick överrepresentationsanalys (ORA) mot Hallmark-databasen med hjälp av webbverktyget WebGestalt. Analysen, som genomfördes den 25 mars 2022, syftade till att jämföra regleringen av proteiner i tänder och implantat mellan T0- och T1-tillstånd. På liknande sätt, den 29 mars 2022, undersökte analysen regleringen av proteiner i både tänder och implantat under antingen T0- eller T1-förhållanden. De 10 bästa berikade resultaten, rangordnade efter p-värde med användning av den hypergeometriska fördelningen, rapporterades. Endast vägar med ett p-värde < 0,05 ansågs dock vara reglerade.