Proteomická analýza nově obnovených jednotlivých implantátů

Studijní populace V období od prosince 2018 do listopadu 2019 bylo přijato celkem 10 systémově zdravých nekuřáků, kteří byli dříve léčeni na onemocnění parodontu a podstoupili implantační terapii. Každý subjekt přispěl nově obnoveným šroubovým implantátem 2-4 týdny po funkční zátěži (výchozí hodnota, T0) a byl pečlivě sledován po dobu 12 měsíců (T1). Všechny studijní implantáty byly platformově přepínané (ø4,1. Straumann® Bone Level) a byly instalovány podle protokolu dvoufázového chirurgického umístění. Jako kontrola sloužil kontralaterální zub ve stejné čelisti, ale v opačném kvadrantu. Umístění implantátu bylo plánováno na základě klinického hodnocení a vyhodnocení pomocí počítačové tomografie s kuželovým svazkem a bylo provedeno s použitím protetického průvodce. Implantáty byly ponořeny a exponovány o 6 měsíců později, když byl na fixturu upraven hojivý pilíř a o měsíc později byla korunka zajištěna šrouby. Kritéria vyloučení zahrnovala věk mladší 18 let, <18 zubů (kromě třetích molárů), neléčené periodontální onemocnění, periodontitida stadium III-IV, průkaz periimplantitidy (Berglundh et al, 2018) na jiných místech implantátu, významná patologie měkkých tkání , neléčené kazivé dutiny (pět a více), systémová onemocnění vyžadující příjem léků, zdravotní stavy, které kontraindikovaly umístění chirurgického implantátu, léky, které narušují kostní metabolismus, těhotenství nebo kojení, nepřiměřené rozměry alveolárního výběžku nebo kosti transplantované při chirurgickém zákroku místě a extrakci zubu 3 měsíce před studií, kouření.

Klinická hodnocení Lokálně specifické klinické indexy a klinické indexy plné úst byly hodnoceny v T0 a T1. Pokyny pro ústní hygienu s použitím manuálního zubního kartáčku a modifikované Bassovy techniky byly znovu opakovány ve čtyřech časových bodech během 12měsíčního období studie (T0, 3-, 6 měsíců a T1). Ve stejných časových bodech byla prováděna profylaxe zahrnující supragingivální ultrazvukový debridement a leštění gumovou miskou. Podrobně, následující místně specifické klinické indexy sondující hloubku kapsy (PPD), úrovně klinického připojení (CAL), recesi (REC), modifikovaný gingivální index (MGI) (rozsah skóre 0-4) (Lobene et al. 1986), modifikovaný index zubního plaku (mPI)1 (rozsah skóre: 0-3) a modifikovaný index krvácení ze sulcus (mBI)1 (rozsah skóre: 0-3) byly stanoveny v meziálním bukálním místě studovaného implantátu podobným způsobem jako PPD , CAL, REC, MGI, index plaku (PI)2 (rozsah skóre: 0-3) a index krvácení ze sulcus (SBI)3 (rozsah skóre: 0-5) v místě kontrolního zubu. Šířka keratinizovaných tkání (KTW) byla stanovena ve středním bukálním aspektu testovaného implantátu/kontrolního zubu. Navíc na základě plných úst PPD, CAL a dichotomický supragingivální zubní plak (PI) (O'Leary et al., 1972) a krvácení při sondování (BOP) (Ainamo et al., 1975) byly zaznamenány na šesti místech na zub/implantát přítomný v ústech. Parodontální klinické indexy byly stanoveny pomocí manuální periodontální sondy (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) s přesností na milimetr.

Radiografické vyšetření Software VixWin™ Platinum Gendex (Hatfield, PA, USA) lineárně hodnotil vzdálenost mezi platformou implantátu a hřebenem kosti (I-BC) paralelně s dlouhou osou fixtury implantátu v T0 a T1 na intraorálním digitálním rentgenové snímky. Periapické digitální rentgenové snímky (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paříž, Francie) byly získány pomocí techniky paralelního paralelního dlouhého kužele ve vzdálenosti 10 cm mezi rentgenovou hlavou a digitálním senzorem.

Odběr vzorků krevikulární tekutiny Peri-implantační krevikulární tekutina (PICF) byla odebrána z mezio-bukálního místa nově obnoveného studijního implantátu, zatímco gingivální krevikulární tekutina (GCF) byla odebrána z mezio-bukálního místa kontralaterálního kontrolního zubu v T0 a T1. Před odběrem PICF/GCF byly povrchy jemně vysušeny na vzduchu a izolovány od slin umístěním bavlněných smotků a použitím odsliňovače. Poté byl opatrně odstraněn supragingivální plak sterilními kyretami a papírové proužky (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) byly jemně umístěny do meziiálního aspektu periimplantátového/gingiválního sulku, dokud nebyl pociťován mírný odpor a drženy po dobu 30 sek. Při vkládání proužků bylo dbáno na to, aby nedošlo k mechanickému poranění a proužky kontaminované krví byly zlikvidovány. Proužky byly skladovány v Eppendorfových zkumavkách (Eppendorf, Hamburg, Německo) při -80 °C až do dalšího zpracování.

Proteomická analýza vzorků crevikulární tekutiny (PICF/GCF) Vzorky PICF a GCF odebrané ze studovaných míst implantátů (n=10) a kontrolních míst zubů (n=10), v tomto pořadí v T0 a T1, byly shromážděny a použity pro proteomickou analýzu . Stručně řečeno, 20 µg celkového proteinu na spojený vzorek bylo redukováno, alkylováno, trypsinizováno a purifikováno štěpením proteinů pomocí přípravku PreOmics' SP3-iST (PreOmics GmbH) v jedné nádobě s vylepšeným přípravkem vzorků na pevné fázi (SP3). výrobní protokol pro extrakci a trávení bílkovin. Tyto extrakty byly koncentrovány pomocí Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) a skladovány při -20 °C až do dalšího použití.

Štěpené vzorky byly nejprve rekonstituovány 30 ul 3% acetonitrilu (ACN) v 0,1% kyselině mravenčí a poté podrobeny hmotnostnímu spektrometru Fusion Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific) propojenému se systémem Easy nano-flow HPLC (Thermo Fisher Scientific) pro proteomiku. analýza. Během proteomické analýzy byl použit třívrstvý gradient acetonitrilu a vody s 0,1% kyselinou mravenčí při průtoku 300 nL/min. Gradient se zvýšil z 2 % na 30 % acetonitrilu během 60 minut, poté z 30 % na 97 % acetonitrilu během 10 minut a nakonec se udržoval na 97 % acetonitrilu po dobu 10 minut. Hmotnostní spektrometr byl nastaven tak, aby fungoval způsobem závislým na datech, automaticky přepínal mezi MS a MS/MS pomocí softwarového balíku Xcalibur od Thermo Fisher Scientific. Pro analyzátor Orbitrap byl zvolen hmotnostní rozsah 300-1500 m/z.

Získaná data MS byla zpracována pomocí Mascot (verze 2.4.1, Vyhledávač Matrix Science) proti interní databázi obsahující 10 125 458 záznamů, které zahrnovaly lidské (22. února 2022 z Uniprotu) a bakteriální (22. února 2022 z eHOMD) proteiny, běžné kontaminanty MS a reverzní sekvence pro odhad míra falešného odhalení. Během proteomické analýzy byla tolerance prekurzorových iontů a tolerance fragmentových iontů nastavena na 10 ppm a ±0,6 Da, v daném pořadí. Pro tryptické štěpení byla povolena až dvě chybějící štěpení na peptid. Modifikace karbamidomethylace na cysteinu byla zvolena jako fixní modifikace, zatímco deamidace asparaginu a glutaminu a oxidace methioninu byly zvoleny jako proměnné modifikační parametry.

Zprávy o spektru výsledků vyhledávání byly vytvořeny pomocí softwaru Scaffold (verze 4.2.1, software Proteome) a proteiny s FDR 1 %, byly identifikovány minimálně 2 jedinečné peptidy, jako peptidová FDR 0,1 %, byly použity pro analýzu relativního množství proteinu. Násobné změny intenzity četnosti byly vypočítány na základě hodnoty log2násobné změny (FC) mezi dvojicemi po sobě jdoucích časových bodů pomocí R-softwaru (R: Jazyk a prostředí pro statistické výpočty, R vývojový hlavní tým). Proteiny s log2FC ≥ 1 jedinečných spekter mezi dvěma stavy nebo výhradně identifikované v jednom stavu byly považovány za regulované.

Bioinformatická analýza regulovaných proteinů Regulované proteiny podstoupily analýzu nadměrného zastoupení (ORA) proti databázi Hallmark pomocí online nástroje WebGestalt. Cílem analýzy provedené 25. března 2022 bylo porovnat regulaci proteinů v zubech a implantátech mezi stavy T0 a T1. Podobně 29. března 2022 analýza zkoumala regulaci proteinů v zubech i implantátech za podmínek T0 nebo T1. Bylo hlášeno 10 nejlepších obohacených výsledků, seřazených podle p-hodnoty pomocí hypergeometrické distribuce. Avšak pouze dráhy s p-hodnotou < 0,05 byly považovány za regulované.