Äskettäin restauroitujen yksittäisten implanttien proteominen analyysi

Tutkimuspopulaatio Joulukuun 2018 ja marraskuun 2019 välisenä aikana rekrytoitiin yhteensä 10 systeemisesti tervettä tupakoimatonta, jotka olivat aiemmin hoidossa parodontaalista ja saivat implanttihoitoa. Jokainen koehenkilö osallistui vastikään kunnostetulla ruuvikiinnitteisellä implantilla 2-4 viikkoa toiminnallisen kuormituksen jälkeen (perustaso, T0) ja häntä seurattiin tarkasti 12 kuukauden ajan (T1). Kaikki tutkimusimplantit olivat alustalla vaihdettuja (ø4.1. Straumann® Bone Level) ja ne asennettiin kaksivaiheisen kirurgisen sijoitusprotokollan mukaisesti. Vastakkainen hammas samassa leuassa, mutta vastakkaisessa kvadrantissa, toimi kontrollina. Implanttien sijoittelu suunniteltiin kliinisen ja kartiosädetietokonetomografian arvioinnin perusteella, ja se suoritettiin proteesioppaan avulla. Implantit upotettiin ja paljastettiin 6 kuukautta myöhemmin, kun kiinnittimeen säädettiin parantavaa tukia, jota seurasi ruuvilla kiinnitetty kruunu 1 kuukautta myöhemmin. Poissulkemiskriteerit sisälsivät alle 18-vuotiaat, alle 18 hammasta (pois lukien kolmannet poskihampaat), hoitamaton parodontaalinen sairaus, periodontiitti vaihe III-IV, todiste periimplantiitista (Berglundh et al, 2018) muissa implanttikohdissa, merkittävä pehmytkudospatologia , hoitamattomat kariesontelot (viisi tai enemmän), systeemiset sairaudet, jotka vaativat lääkkeiden ottamista, sairaudet, jotka ovat vasta-aiheisia kirurgisen implantin asettamiseen, luun aineenvaihduntaa häiritsevät lääkkeet, raskaus tai imetys, keuhkorakkuloiden harjanteen tai siirretyn luun riittämättömät mitat leikkauksessa hampaanpoisto 3 kuukautta ennen tutkimusta, tupakointi.

Kliiniset arvioinnit Paikkakohtaiset ja koko suun kliiniset indeksit arvioitiin T0 ja T1. Suun hygieniaohjeet manuaalisella hammasharjalla ja modifioidulla Bass-tekniikalla toistettiin neljässä ajankohdassa 12 kuukauden tutkimusjakson aikana (T0, 3, 6 kuukautta ja T1). Profylaksia, joka sisälsi supragingivaalisen ultraäänipuhdistuksen ja kiillotuksen kumikupilla, suoritettiin samaan aikaan. Yksityiskohtaisesti seuraavat paikkakohtaiset kliiniset indeksit, jotka mittaavat taskun syvyyttä (PPD), kliinisen kiinnittymisen tasoja (CAL), taantumaa (REC), modifioitua ienindeksiä (MGI) (pistemäärä 0-4) (Lobene et al. 1986), modifioitu hammasplakkiindeksi (mPI)1 (pistemääräalue: 0-3) ja modifioitu sulcus-verenvuotoindeksi (mBI)1 (pistemääräalue: 0-3) määritettiin tutkimusimplanttien mesiaalisesta bukkaalikohdasta samalla tavalla kuin PPD. , CAL, REC, MGI, plakkiindeksi (PI)2 (pistemäärä: 0-3) ja sulcus verenvuotoindeksi (SBI)3 (pistemäärä: 0-5) kontrollihampaan kohdalla. Keratinisoituneiden kudosten leveys (KTW) määritettiin koe-implantti/kontrollihampaan bukkaalisessa osassa. Lisäksi koko suun pohjalta mitattuna PPD, CAL ja dikotominen supragingivaalinen hammasplakki (PI) (O'Leary et al., 1972) ja verenvuoto koetuksella (BOP) (Ainamo et al., 1975) rekisteröitiin kuudessa paikassa per suussa oleva hammas/implantti. Parodontaaliset kliiniset indeksit määritettiin käyttämällä manuaalista parodontaalista koetinta (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) lähimpään millimetriin.

Röntgentutkimus VixWin™ Platinum Gendex -ohjelmisto (Hatfield, PA, USA) arvioi lineaarisesti implantin alustan ja luun harjan välisen etäisyyden (I-BC) yhdensuuntaisesti implantin kiinnittimen pitkän akselin kanssa kohdissa T0 ja T1 intraoraalisella digitaalisella laitteella. röntgenkuvat. Periapikaaliset digitaaliset röntgenkuvat (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Pariisi, Ranska) saatiin käyttämällä pitkän kartion rinnakkaistekniikkaa 10 cm:n etäisyydellä röntgenpään ja digitaalisen anturin välillä.

crevicular-nestenäytteiden kerääminen Implanttien ympärillä oleva crevicular neste (PICF) kerättiin vasta kunnostetun tutkimusimplanttien mesiaali-bukkaalikohdasta, kun taas ienneste (GCF) kerättiin kontralateraalisen kontrollihampaan mesiaali-bukkaalista kohdasta T0. ja T1. Ennen PICF/GCF-keräystä pinnat ilmakuivattiin varovasti ja eristettiin syljestä asettamalla puuvillarullat ja käyttämällä syljenpoistolaitetta. Sitten supragingivaalinen plakki poistettiin varovasti steriileillä kyreteillä ja paperiliuskoja (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) asetettiin varovasti implantin/gingivaalisen sulcusin mesiaaliseen osaan, kunnes tunsi lievää vastustusta, ja pidettiin 30 minuuttia. sek. Liuskoja asetettaessa varottiin mekaanisten vammojen välttämisestä ja veren saastuttamat liuskat heitettiin pois. Liuskoja säilytettiin Eppendorf-putkissa (Eppendorf, Hampuri, Saksa) -80 °C:ssa jatkokäsittelyyn asti.

Pölynestenäytteiden proteominen analyysi (PICF/GCF) Tutkimuksen implanttipaikoista (n=10) ja kontrollihammaskohdista (n=10) pisteissä T0 ja T1 otetut PICF- ja GCF-näytteet yhdistettiin ja käytettiin proteomiikkaanalyysiin. . Lyhyesti sanottuna 20 µg kokonaisproteiinia yhdistettyä näytettä kohden pelkistettiin, alkyloitiin, trypsinoitiin ja puhdistettiin yksiastiaisella, kiinteäfaasisella tehostetulla näytevalmisteella (SP3) avustetulla proteiinidigestiolla käyttäen PreOmicsin SP3-iST:tä (PreOmics GmbH) seuraavalla tavalla. valmistusprotokolla proteiinien uuttamiseen ja pilkkomiseen. Nämä uutteet konsentroitiin käyttämällä Speedvacia (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja säilytettiin -20 °C:ssa jatkokäyttöön asti.

Digestoidut näytteet liuotettiin ensin 30 µl:lla 3-prosenttista asetonitriiliä (ACN) 0,1-prosenttisessa muurahaishapossa ja sitten altistettiin Fusion Orbitrap Lumos -massaspektrometrille (Thermo Fisher Scientific), joka oli liitetty Easy-nano-flow HPLC-järjestelmään (Thermo Fisher Scientific) proteomiikkaa varten. analyysi. Proteomiikan analyysin aikana käytettiin asetonitriilin ja veden kolmilinjaista gradienttia 0,1 % muurahaishapon kanssa virtausnopeudella 300 nl/minuutti. Gradientti eteni 2 %:sta 30 %:iin asetonitriiliä 60 minuutissa, sitten 30 %:sta 97 %:iin asetonitriiliä 10 minuutissa, ja lopuksi pidettiin 97 % asetonitriilissä 10 minuuttia. Massaspektrometri asetettiin toimimaan tiedoista riippuvaisella tavalla, vaihtaen automaattisesti MS:n ja MS/MS:n välillä käyttämällä Thermo Fisher Scientificin Xcalibur-ohjelmistopakettia. Orbitrap-analysaattorin massaalueeksi valittiin 300-1500 m/z.

Hankitut MS-tiedot käsiteltiin Mascotilla (versio 2.4.1, Matrix Science) -hakukone talon sisäiseen tietokantaan, joka sisältää 10 125 458 merkintää, jotka sisälsivät ihmisen (22. helmikuuta 2022 Uniprotilta) ja bakteeriproteiineja (saatu 22. helmikuuta 2022 eHOMD:ltä), yleisiä MS-kontaminantteja ja käänteisiä sekvenssejä väärien löytöjen määrä. Proteomiikan analyysin aikana prekursori-ionien sietokyky ja fragmentti-ionien sietokyky asetettiin arvoon 10 ppm ja ±0,6 Da, vastaavasti. Jopa kaksi puuttuvaa katkaisua peptidiä kohden sallittiin tryptistä pilkkomista varten. Kiinteäksi modifikaatioksi valittiin kysteiinin karbamidomeylaatiomodifikaatio, kun taas asparagiinin ja glutamiinin deamidaatio ja metioniinin hapetus valittiin muuttuviksi modifikaatioparametreiksi.

Hakutulosten spektriraportit luotiin käyttämällä Scaffold-ohjelmistoa (versio 4.2.1, Proteome-ohjelmisto), ja proteiineja, joiden FDR oli 1 %, vähintään 2 yksilöllistä peptidiä tunnistettiin peptidi-FDR-arvoksi 0,1 %, käytettiin suhteellisen proteiinien runsausanalyysiin. Runsauden intensiteetin kertaiset muutokset laskettiin log2-kertaisen muutoksen (FC) perusteella peräkkäisten aikapisteiden parien välillä käyttämällä R-ohjelmistoa (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Proteiineja, joiden log2FC oli ≥ 1 ainutlaatuisesta spektrimäärästä kahden tilan välillä tai jotka tunnistettiin yksinomaan yhdessä tilassa, katsottiin säädellyiksi.

Säädeltyjen proteiinien bioinformatiikka-analyysi Säädellyille proteiineille tehtiin ylirepresentaatioanalyysi (ORA) Hallmark-tietokantaa vastaan ​​käyttämällä WebGestalt-verkkotyökalua. 25. maaliskuuta 2022 tehdyn analyysin tarkoituksena oli verrata hampaiden ja implanttien proteiinien säätelyä T0- ja T1-tilojen välillä. Vastaavasti 29.3.2022 analyysissä tarkasteltiin proteiinien säätelyä sekä hampaissa että implanteissa joko T0- tai T1-olosuhteissa. 10 parasta rikastettua tulosta, jotka oli luokiteltu p-arvon mukaan käyttämällä hypergeometristä jakaumaa, raportoitiin. Kuitenkin vain reittejä, joiden p-arvo < 0,05, pidettiin säänneltyinä.