Протеомный анализ недавно восстановленных одиночных имплантатов

В период с декабря 2018 года по ноябрь 2019 года в исследование были включены в общей сложности 10 системно здоровых некурящих, которые ранее лечились от заболеваний пародонта и получали имплантологическую терапию. Каждый субъект вносил свой вклад в установку вновь восстановленного имплантата с винтовой фиксацией через 2–4 недели после функциональной нагрузки (исходный уровень, Т0) и находился под тщательным наблюдением в течение 12 месяцев (Т1). Все исследуемые имплантаты имели переключение платформ (диаметр 4,1. Straumann® Bone Level) и были установлены в соответствии с двухэтапным хирургическим протоколом установки. Контролем служил контрлатеральный зуб той же челюсти, но в противоположном квадранте. Установка имплантата планировалась на основе клинических данных и оценок конусно-лучевой компьютерной томографии и выполнялась с использованием протезного шаблона. Имплантаты были погружены в воду и обнажены через 6 месяцев, когда на приспособлении был установлен формирователь десны, а через 1 месяц была установлена ​​коронка с винтовой фиксацией. Критерии исключения включали возраст младше 18 лет, <18 зубов (исключая третьи моляры), нелеченный пародонтит, пародонтит III-IV стадии, признаки периимплантита (Berglundh et al, 2018) в других местах имплантации, значительную патологию мягких тканей. , нелеченные кариозные полости (пять и более), системные заболевания, требующие приема медикаментов, заболевания, при которых противопоказана хирургическая установка имплантатов, прием препаратов, нарушающих костный метаболизм, беременность или лактация, недостаточные размеры альвеолярного отростка или трансплантированной кости в хирургическом отделении. месте и удалении зуба за 3 месяца до исследования, курение.

Клинические оценки Клинические показатели, специфичные для конкретного участка и всего рта, оценивались на Т0 и Т1. Инструкции по гигиене полости рта с использованием ручной зубной щетки и модифицированной техники Басса повторялись в четырех временных точках в течение 12-месячного периода исследования (Т0, 3-, 6-месячный и Т1). В те же моменты времени проводилась профилактика, включающая наддесневую ультразвуковую обработку и полировку резиновой чашкой. Подробно, следующие клинические индексы для конкретных участков, определяющие глубину кармана (PPD), уровни клинического прикрепления (CAL), рецессию (REC), модифицированный десневой индекс (MGI) (диапазон оценок 0–4) (Lobene et al. 1986), модифицированный индекс зубного налета (mPI)1 (диапазон оценок: 0–3) и модифицированный индекс кровоточивости борозды (mBI)1 (диапазон оценок: 0–3) определяли в мезиально-буккальном участке исследуемого имплантата аналогично PPD. , CAL, REC, MGI, индекс бляшек (PI)2 (диапазон оценок: 0–3) и индекс кровоточивости борозд (SBI)3 (диапазон оценок: 0–5) на участке контрольного зуба. Ширину кератинизированных тканей (KTW) определяли в средней щечной части тестируемого имплантата/контрольного зуба. Более того, при исследовании всего рта PPD, CAL и дихотомические наддесневые зубные бляшки (PI) (O'Leary et al., 1972) и кровотечение при зондировании (BOP) (Ainamo et al., 1975) были зарегистрированы в шести местах на каждый наличие зуба/имплантата во рту. Клинические показатели пародонта определяли с использованием ручного пародонтального зонда (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Чикаго, Иллинойс, США) с точностью до миллиметра.

Рентгенографическое исследование. Программное обеспечение VixWin™ Platinum Gendex (Хэтфилд, Пенсильвания, США) линейно оценивало расстояние между платформой имплантата и костным гребнем (I-BC) параллельно длинной оси имплантата в точках Т0 и Т1 на внутриротовом цифровом исследовании. рентгенограммы. Периапикальные цифровые рентгенограммы (RadioVisioGrapy; Trophy Radiology S.A., Париж, Франция) были получены с использованием техники параллельного длинного конуса на расстоянии 10 см между рентгеновской головкой и цифровым датчиком.

Сбор образцов десневой жидкости. Периимплантатную десневую жидкость (PICF) собирали из мезиально-щечной области недавно восстановленного исследуемого имплантата, а десневую десневую жидкость (GCF) собирали из мезиально-щечной области контралатерального контрольного зуба в точке T0. и Т1. Перед сбором PICF/GCF поверхности осторожно высушивались на воздухе и изолировались от слюны путем размещения ватных валиков и использования слюноотсоса. Затем наддесневой налет осторожно удалили стерильными кюретками и бумажные полоски (Periopaper, OraFlow Inc., Смиттаун, Нью-Йорк, США) осторожно поместили в мезиальную часть периимплантата/десневой борозды до тех пор, пока не почувствуется легкое сопротивление, и удерживали в течение 30 минут. сек. При размещении полосок принимали меры предосторожности, чтобы избежать механических травм, а полоски, загрязненные кровью, выбрасывали. Полоски хранили в пробирках Эппендорф (Эппендорф, Гамбург, Германия) при -80°С до дальнейшей обработки.

Протеомный анализ образцов жидкости щели (PICF/GCF). Образцы PICF и GCF, собранные из исследуемых участков имплантата (n=10) и контрольных участков зуба (n=10), соответственно в Т0 и Т1, были объединены и использованы для протеомного анализа. . Вкратце, 20 мкг общего белка на объединенный образец были восстановлены, алкилированы, трипсинизированы и очищены с помощью однокамерной пробоподготовки с твердофазным усилением (SP3), способствующей расщеплению белка с использованием PreOmics SP3-iST (PreOmics GmbH) после производственный протокол экстракции и переваривания белка. Эти экстракты концентрировали с помощью Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и хранили при -20 °C до дальнейшего использования.

Переваренные образцы сначала восстанавливали с помощью 30 мкл 3% ацетонитрила (ACN) в 0,1% муравьиной кислоты, затем подвергали масс-спектрометру Fusion Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific), соединенному с системой Easy nano-flow HPLC (Thermo Fisher Scientific) для протеомики. анализ. Во время протеомного анализа использовали трехстрочный градиент ацетонитрила и воды с 0,1% муравьиной кислоты при скорости потока 300 нл/мин. Градиент прогрессировал от 2% до 30% ацетонитрила в течение 60 минут, затем от 30% до 97% ацетонитрила за 10 минут и, наконец, поддерживался на уровне 97% ацетонитрила в течение 10 минут. Масс-спектрометр был настроен на работу в зависимости от данных с автоматическим переключением между МС и МС/МС с использованием пакета программного обеспечения Xcalibur от Thermo Fisher Scientific. Для анализатора Orbitrap был выбран диапазон масс 300–1500 m/z.

Полученные данные МС обрабатывали с помощью программы Mascot (версия 2.4.1, Matrix Science) по внутренней базе данных, содержащей 10 125 458 записей, которые включали человеческие (доступ 22 февраля 2022 года из Uniprot) и бактериальные (доступ 22 февраля 2022 года из eHOMD) белки, распространенные примеси рассеянного склероза и обратные последовательности для оценки уровень ложного обнаружения. В ходе протеомного анализа толерантность к ионам-предшественникам и толерантность к фрагментным ионам были установлены на уровне 10 ppm и ±0,6 Да соответственно. Для расщепления трипсином допускалось до двух пропущенных расщеплений на пептид. Модификация карбамидометилирования цистеина была выбрана в качестве фиксированной модификации, тогда как дезамидирование аспарагина и глутамина и окисление метионина были выбраны в качестве переменных параметров модификации.

Отчеты о спектре результатов поиска были созданы с использованием программного обеспечения Scaffold (версия 4.2.1, программное обеспечение Proteome), а белки с FDR на уровне 1%, идентифицированные минимум 2 уникальных пептида, а пептид FDR на уровне 0,1% использовались для анализа относительного содержания белков. Кратные изменения интенсивности численности рассчитывались на основе кратного изменения значения log2 (FC) между парами последовательных моментов времени с использованием R-программного обеспечения (R: Язык и среда для статистических вычислений, Основная группа разработчиков R). Белки с log2FC ≥ 1 уникальных значений спектра между двумя условиями или идентифицированные исключительно в одном состоянии считались регулируемыми.

Биоинформатический анализ регулируемых белков. Регулируемые белки подверглись анализу перепредставления (ORA) по базе данных Hallmark с использованием онлайн-инструмента WebGestalt. Анализ, проведенный 25 марта 2022 г., был направлен на сравнение регуляции белков в зубах и имплантатах в состояниях Т0 и Т1. Аналогичным образом, 29 марта 2022 года в ходе анализа изучалась регуляция белков как в зубах, так и в имплантатах в условиях Т0 или Т1. Были представлены 10 лучших расширенных результатов, ранжированных по значению p с использованием гипергеометрического распределения. Однако регулируемыми считались только пути со значением p <0,05.