Análisis proteómico de implantes individuales recién restaurados

Población de estudio Un total de 10 no fumadores sistémicamente sanos, que fueron tratados previamente por enfermedad periodontal y recibieron terapia con implantes, fueron reclutados entre diciembre de 2018 y noviembre de 2019. Cada sujeto contribuyó con un implante atornillado recién restaurado de 2 a 4 semanas después de la carga funcional (línea de base, T0) y fue seguido de cerca durante 12 meses (T1). Todos los implantes del estudio fueron de plataforma conmutada (ø4,1. Straumann® Bone Level) y se instalaron siguiendo un protocolo de colocación quirúrgica en dos etapas. Un diente contralateral en la misma mandíbula, pero en el cuadrante opuesto, sirvió como control. La colocación del implante se planificó en base a evaluaciones clínicas y de tomografía computarizada de haz cónico y se realizó utilizando una guía protésica. Los implantes se sumergieron y quedaron expuestos 6 meses después cuando se ajustó un pilar de cicatrización en el dispositivo seguido de una corona atornillada 1 mes después. Los criterios de exclusión incluyeron menores de 18 años, <18 dientes (excluyendo terceros molares), enfermedad periodontal no tratada, periodontitis en estadio III-IV, evidencia de periimplantitis (Berglundh et al, 2018) en otros sitios de implante, patología significativa de los tejidos blandos. , caries no tratadas (cinco o más), enfermedades sistémicas que requieren la ingesta de medicamentos, condiciones médicas que contraindican la colocación de implantes quirúrgicos, medicamentos que interfieren con el metabolismo óseo, embarazo o lactancia, dimensiones inadecuadas de la cresta alveolar o del hueso injertado en el punto quirúrgico sitio y extracción dental 3 meses antes del estudio, tabaquismo.

Evaluaciones clínicas Los índices clínicos específicos del sitio y de boca completa se evaluaron en T0 y T1. Las instrucciones de higiene bucal utilizando un cepillo de dientes manual y la técnica de Bass modificada se reiteraron en cuatro momentos durante el período de estudio de 12 meses (T0, 3, 6 meses y T1). La profilaxis que comprendía desbridamiento ultrasónico supragingival y pulido con una copa de goma se llevó a cabo en los mismos momentos. En detalle, los siguientes índices clínicos específicos del sitio sondean la profundidad de la bolsa (PPD), los niveles de inserción clínica (CAL), la recesión (REC), el índice gingival modificado (MGI) (rango de puntuación 0-4) (Lobene et al. 1986), El índice de placa dental modificado (mPI)1 (rango de puntuación: 0-3) y el índice de sangrado del surco modificado (mBI)1 (rango de puntuación: 0-3) se determinaron en el sitio bucal mesial del implante del estudio de manera similar al PPD. , CAL, REC, MGI, índice de placa (PI)2 (rango de puntuación: 0-3) e índice de sangrado del surco (SBI)3 (rango de puntuación: 0-5) en el sitio del diente de control. El ancho de los tejidos queratinizados (KTW) se determinó en la cara media vestibular del implante de prueba/diente de control. Además, en toda la boca se registraron PPD, CAL y placa dental supragingival (PI) dicotómica (O'Leary et al., 1972) y sangrado al sondaje (BOP) (Ainamo et al., 1975) en seis sitios por diente/implante presente en la boca. Los índices clínicos periodontales se determinaron utilizando una sonda periodontal manual (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, EE. UU.) al milímetro más cercano.

Examen radiográfico El software VixWin™ Platinum Gendex (Hatfield, PA, EE. UU.) evaluó linealmente la distancia entre la plataforma del implante y la cresta ósea (I-BC) paralela al eje longitudinal del implante en T0 y T1 en imágenes digitales intraorales. radiografías. Las radiografías digitales periapicales (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., París, Francia) se obtuvieron utilizando la técnica de paralelismo de cono largo a una distancia de 10 cm entre el cabezal de rayos X y el sensor digital.

Recolección de muestras de líquido crevicular El líquido crevicular periimplantario (PICF) se recogió del sitio mesiovestibular del implante de estudio recién restaurado, mientras que el líquido crevicular gingival (GCF) se recogió del sitio mesiovestibular de un diente de control contralateral en T0 y T1. Antes de la recolección de PICF/GCF, las superficies se secaron suavemente al aire y se aislaron de la saliva colocando rollos de algodón y usando un eyector de saliva. Luego, se eliminó cuidadosamente la placa supragingival mediante curetas estériles y se colocaron suavemente tiras de papel (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, EE. UU.) en la cara mesial del surco periimplantario/gingival hasta que se sintió una leve resistencia y se mantuvo durante 30 minutos. segundo. Se tuvo cuidado de evitar traumatismos mecánicos al colocar las tiras y se descartaron aquellas contaminadas con sangre. Las tiras se almacenaron en tubos Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

Análisis proteómico de muestras de líquido crevicular (PICF/GCF) Las muestras de PICF y GCF recolectadas de los sitios de implantes del estudio (n=10) y de los sitios de los dientes de control (n=10), respectivamente en T0 y T1, se combinaron y utilizaron para el análisis proteómico. . En resumen, se redujeron, alquilaron, tripsinizaron y purificaron 20 µg de proteína total por muestra combinada con digestión de proteínas asistida por preparación de muestra mejorada en fase sólida (SP3) en un solo recipiente utilizando el SP3-iST de PreOmics (PreOmics GmbH) siguiendo el protocolo de fabricación para la extracción y digestión de proteínas. Estos extractos se concentraron usando un Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.

Las muestras digeridas se reconstituyeron primero con 30 µl de acetonitrilo (ACN) al 3 % en ácido fórmico al 0,1 % y luego se sometieron a un espectrómetro de masas Fusion Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific) conectado a un sistema HPLC de nanoflujo Easy (Thermo Fisher Scientific) para proteómica. análisis. Durante el análisis proteómico, se utilizó un gradiente de tres líneas de acetonitrilo y agua con ácido fórmico al 0,1% a un caudal de 300 nl/minuto. El gradiente progresó del 2% al 30% de acetonitrilo durante 60 minutos, luego del 30% al 97% de acetonitrilo en 10 minutos y finalmente se mantuvo al 97% de acetonitrilo durante 10 minutos. El espectrómetro de masas se configuró para funcionar de manera dependiente de los datos, cambiando automáticamente entre MS y MS/MS utilizando el paquete de software Xcalibur de Thermo Fisher Scientific. Se seleccionó un rango de masa de 300-1500 m/z para el analizador Orbitrap.

Los datos de MS adquiridos se procesaron utilizando Mascot (versión 2.4.1, Matrix Science) frente a una base de datos interna que contiene 10.125.458 entradas, que incluían proteínas humanas (consultada el 22 de febrero de 2022 desde Uniprot) y bacterianas (consultada el 22 de febrero de 2022 desde eHOMD), contaminantes comunes de la EM y secuencias inversas para estimar la tasa de descubrimiento falso. Durante el análisis proteómico, la tolerancia a los iones precursores y la tolerancia a los iones fragmentos se establecieron en 10 ppm y ±0,6 Da, respectivamente. Se permitieron hasta dos escisiones omitidas por péptido para la digestión tríptica. La modificación por carbamidometilación de cisteína se seleccionó como modificación fija, mientras que la desamidación de asparagina y glutamina y la oxidación de metionina se eligieron como parámetros de modificación variables.

Los informes de espectro de los resultados de la búsqueda se generaron utilizando el software Scaffold (versión 4.2.1, software Proteome) y proteínas con FDR al 1%, se identificaron como mínimo 2 péptidos únicos, ya que el péptido FDR al 0,1% se utilizó para el análisis de abundancia relativa de proteínas. Los cambios en la intensidad de la abundancia se calcularon en función del valor del cambio en log2 (FC) entre pares de puntos de tiempo consecutivos utilizando el software R (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Las proteínas con un log2FC ≥ 1 de recuentos de espectro únicos entre dos condiciones o identificadas exclusivamente en una condición se consideraron reguladas.

Análisis bioinformático de las proteínas reguladas Las proteínas reguladas se sometieron a un análisis de sobrerrepresentación (ORA) frente a la base de datos Hallmark utilizando la herramienta en línea WebGestalt. El análisis, realizado el 25 de marzo de 2022, tenía como objetivo comparar la regulación de las proteínas en dientes e implantes entre las condiciones T0 y T1. De manera similar, el 29 de marzo de 2022, el análisis examinó la regulación de las proteínas tanto en los dientes como en los implantes en condiciones T0 o T1. Se informaron los 10 resultados enriquecidos principales, clasificados por valor p utilizando la distribución hipergeométrica. Sin embargo, solo las vías con un valor de p <0,05 se consideraron reguladas.