新修复的单个植入物的蛋白质组学分析

研究人群 2018 年 12 月至 2019 年 11 月期间，共招募了 10 名全身健康的非吸烟者，他们之前接受过牙周病治疗并接受过种植治疗。 每个受试者在功能负荷后 2-4 周（基线，T0）植入新修复的螺丝固位种植体，并进行超过 12 个月的密切随访（T1）。 所有研究种植体均采用平台转换（ø4.1. Straumann® 骨水平）并按照两阶段手术放置方案进行安装。 同一颌中但位于相反象限的对侧牙齿作为对照。 种植体植入是根据临床和锥形束计算机断层扫描评估来规划的，并使用假体导板进行。 种植体被浸没并在 6 个月后暴露出来，当时在固定器上调整了愈合基台，然后在 1 个月后调整了螺丝固位牙冠。 排除标准包括年龄小于 18 岁、<18 颗牙齿（不包括第三磨牙）、未经治疗的牙周病、牙周炎 III-IV 期、其他种植部位有种植体周围炎的证据（Berglundh 等，2018）、显着的软组织病理学、未经治疗的龋洞（五个或更多）、需要服用药物的全身性疾病、不适合手术植入的医疗状况、干扰骨代谢的药物、怀孕或哺乳期、手术时牙槽嵴或移植骨尺寸不足研究前 3 个月吸烟。

临床评估 在 T0 和 T1 评估部位特异性和全口临床指数。 在 12 个月的研究期间（T0、3 个月、6 个月和 T1），在四个时间点重复使用手动牙刷和改进的 Bass 技术的口腔卫生说明。 在同一时间点进行预防，包括龈上超声清创和用橡胶杯抛光。 详细而言，以下特定部位的临床指数探测袋深度（PPD）、临床附着水平（CAL）、退缩（REC）、改良牙龈指数（MGI）（评分范围 0-4）（Lobene 等人 1986），以与 PPD 类似的方式在研究种植体的近颊部位测定改良牙菌斑指数 (mPI)1（评分范围：0-3）和改良牙沟出血指数 (mBI)1（评分范围：0-3） 、CAL、REC、MGI、对照牙齿部位的菌斑指数 (PI)2（分数范围：0-3）和龈沟出血指数 (SBI)3（分数范围：0-5）。 角化组织的宽度 (KTW) 在测试种植体/对照牙齿的中颊侧确定。 此外，在全口基础上，每个部位的六个位点记录了 PPD、CAL 和二叉龈上牙菌斑 (PI)（O'Leary 等人，1972 年）和探诊出血 (BOP)（Ainamo 等人，1975 年）。口腔中存在牙齿/种植体。 使用手动牙周探针（PCP-UNC 15；Hu-Friedy XP-23/QW，Hu-Friedy，芝加哥，伊利诺伊州，美国）确定牙周临床指数，精确到毫米。

射线照相检查 VixWin™ Platinum Gendex 软件（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）在口腔数字化 T0 和 T1 处线性评估种植体平台和骨嵴 (I-BC) 之间平行于种植体固定装置长轴的距离放射线照片。 使用长圆锥平行技术在 X 射线头和数字传感器之间距离 10 厘米处获得根尖数字射线照片（RadioVisioGraphy；Trophy Radiology S.A.，巴黎，法国）。

沟液样本的收集 种植体周围沟液（PICF）是从新修复的研究种植体的近颊部位收集的，而龈沟液（GCF）是从 T0 时对侧对照牙齿的近颊部位收集的和T1。 在收集 PICF/GCF 之前，将表面轻轻风干，并通过放置棉卷并使用唾液喷射器将其与唾液隔离。 然后，用无菌刮匙小心地去除龈上菌斑，并将纸条（Periopaper，OraFlow Inc.，Smithtown，NY，USA）轻轻放置在种植体周围/牙龈沟的近中，直到感觉到轻微的阻力并保持 30 秒。秒。 放置试纸条时要小心避免机械损伤，并丢弃那些被血液污染的试纸条。 将条带储存在-80°C的Eppendorf管（Eppendorf，汉堡，德国）中直至进一步处理。

裂隙液样本的蛋白质组学分析 (PICF/GCF) 分别在 T0 和 T1 时从研究种植体位点 (n=10) 和对照牙齿位点 (n=10) 采集的 PICF 和 GCF 样本被合并并用于蛋白质组学分析。 简而言之，使用 PreOmics 的 SP3-iST (PreOmics GmbH) 通过单锅固相增强样品制备 (SP3) 辅助蛋白质消化，对每个合并样品 20 µg 总蛋白进行还原、烷基化、胰蛋白酶化和纯化，如下蛋白质提取和消化的生产方案。 使用 Speedvac（Thermo Savant SPD121P，Thermo Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）浓缩这些提取物，并储存在 -20 °C 直至进一步使用。

首先用 30 µL 3% 乙腈 (ACN) 的 0.1% 甲酸溶液复溶消化后的样品，然后使用与 Easy 纳流 HPLC 系统 (Thermo Fisher Scientific) 连接的 Fusion Orbitrap Lumos 质谱仪 (Thermo Fisher Scientific) 进行蛋白质组学分析分析。 在蛋白质组学分析过程中，使用乙腈和水的三线梯度以及 0.1% 甲酸，流速为 300 nL/分钟。 梯度在 60 分钟内从 2% 乙腈发展到 30% 乙腈，然后在 10 分钟内从 30% 乙腈发展到 97% 乙腈，最后在 97% 乙腈保持 10 分钟。 质谱仪设置为以数据依赖方式运行，使用 Thermo Fisher Scientific 的 Xcalibur 软件包在 MS 和 MS/MS 之间自动切换。 Orbitrap 分析仪选择的质量范围为 300-1500 m/z。

使用 Mascot（版本 2.4.1， Matrix Science）搜索引擎针对包含 10,125,458 个条目的内部数据库，其中包括人类（2022 年 2 月 22 日从 Uniprot 访问）和细菌（2022 年 2 月 22 日从 eHOMD 访问）蛋白质、常见 MS 污染物以及用于估计错误发现率。 在蛋白质组学分析过程中，前体离子耐受性和碎片离子耐受性分别设置为10 ppm和±0.6 Da。 每个肽最多允许有两次漏切用于胰蛋白酶消化。 选择半胱氨酸的脲甲基化修饰作为固定修饰，选择天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺以及蛋氨酸的氧化作为可变修饰参数。

使用Scaffold软件（版本4.2.1，Proteome软件）生成搜索结果的光谱报告，并且鉴定出FDR为1%的蛋白质，最少鉴定出2个独特的肽，因为肽FDR为0.1%用于相对蛋白质丰度分析。 使用 R 软件（R：统计计算语言和环境，R 开发核心团队）根据连续时间点对之间的值 log2 倍数变化 (FC) 计算丰度强度的倍数变化。 两种条件之间的独特光谱计数 log2FC ≥ 1 或在一种条件下专门鉴定的蛋白质被认为是受监管的。

受调节蛋白的生物信息学分析 使用 WebGestalt 在线工具针对 Hallmark 数据库对受调节蛋白进行过度表达分析 (ORA)。 该分析于 2022 年 3 月 25 日进行，旨在比较 T0 和 T1 条件下牙齿和种植体中蛋白质的调节。 同样，2022 年 3 月 29 日，该分析检查了 T0 或 T1 条件下牙齿和种植体中蛋白质的调节情况。 报告了使用超几何分布按 p 值排名的前 10 个富集结果。 然而，只有 p 值 < 0.05 的途径才被视为受监管。