Proteomische Analyse neu restaurierter Einzelimplantate

Studienpopulation Zwischen Dezember 2018 und November 2019 wurden insgesamt 10 systemisch gesunde Nichtraucher rekrutiert, die zuvor wegen Parodontitis behandelt und eine Implantattherapie erhalten hatten. Jeder Proband leistete 2–4 Wochen nach der funktionellen Belastung (Ausgangswert, T0) einen Beitrag mit einem neu wiederhergestellten, verschraubten Implantat und wurde über 12 Monate (T1) genau beobachtet. Alle Studienimplantate waren Platform-Switched (ø4,1). Straumann® Bone Level) und wurden nach einem zweistufigen chirurgischen Platzierungsprotokoll installiert. Als Kontrolle diente ein kontralateraler Zahn im selben Kiefer, aber im gegenüberliegenden Quadranten. Die Implantatinsertion wurde auf der Grundlage klinischer und kegelförmiger Computertomographie-Bewertungen geplant und unter Verwendung einer prothetischen Schablone durchgeführt. Die Implantate wurden eingetaucht und 6 Monate später freigelegt, als ein Gingivaformer auf der Vorrichtung angepasst wurde, gefolgt von einer verschraubten Krone einen Monat später. Zu den Ausschlusskriterien gehörten jünger als 18 Jahre, <18 Zähne (ohne dritte Molaren), unbehandelte Parodontitis, Parodontitis im Stadium III–IV, Hinweise auf Periimplantitis (Berglundh et al., 2018) an anderen Implantationsstellen und signifikante Weichteilpathologie , unbehandelte kariöse Hohlräume (fünf oder mehr), systemische Erkrankungen, die die Einnahme von Medikamenten erfordern, medizinische Bedingungen, die eine chirurgische Implantatinsertion kontraindizieren, Medikamente, die den Knochenstoffwechsel beeinträchtigen, Schwangerschaft oder Stillzeit, unzureichende Abmessungen des Alveolarkamms oder des transplantierten Knochens beim chirurgischen Eingriff Standort und Zahnextraktion 3 Monate vor der Studie, Rauchen.

Klinische Bewertungen Ortsspezifische und klinische Indizes für den gesamten Mund wurden zu T0 und T1 bewertet. Mundhygieneanweisungen mit einer Handzahnbürste und der modifizierten Bass-Technik wurden zu vier Zeitpunkten im 12-monatigen Studienzeitraum (T0, 3, 6 Monate und T1) wiederholt. Zu den gleichen Zeitpunkten wurde eine Prophylaxe durchgeführt, die ein supragingivales Ultraschall-Debridement und Polieren mit einem Gummikelch umfasste. Im Einzelnen werden die folgenden ortsspezifischen klinischen Indizes untersucht: Taschentiefe (PPD), klinische Bindungsniveaus (CAL), Rezession (REC), modifizierter Gingivaindex (MGI) (Score-Bereich 0–4) (Lobene et al. 1986), Der modifizierte Dental Plaque Index (mPI)1 (Score-Bereich: 0–3) und der modifizierte Sulcus Bleeding Index (mBI)1 (Score-Bereich: 0–3) wurden an der mesial-bukkalen Stelle des Studienimplantats auf ähnliche Weise wie PPD bestimmt , CAL, REC, MGI, Plaque-Index (PI)2 (Score-Bereich: 0-3) und Sulcus-Bleeding-Index (SBI)3 (Score-Bereich: 0-5) an der Kontrollzahnstelle. Die Breite des keratinisierten Gewebes (KTW) wurde im mittleren bukkalen Bereich des Testimplantats/Kontrollzahns bestimmt. Darüber hinaus wurden PPD, CAL und dichotomer supragingivaler Zahnbelag (PI) (O'Leary et al., 1972) sowie Blutungen beim Sondieren (BOP) (Ainamo et al., 1975) an sechs Stellen pro Mund erfasst Zahn/Implantat im Mund. Die parodontalen klinischen Indizes wurden mit einer manuellen Parodontalsonde (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) auf den Millimeter genau bestimmt.

Röntgenuntersuchung Mit der VixWin™ Platinum Gendex-Software (Hatfield, PA, USA) wurde der Abstand zwischen der Implantatplattform und dem Knochenkamm (I-BC) parallel zur Längsachse der Implantathalterung bei T0 und T1 intraoral digital ermittelt Röntgenaufnahmen. Periapikale digitale Röntgenaufnahmen (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, Frankreich) wurden mit der Langkegel-Paralleltechnik in einem Abstand von 10 cm zwischen dem Röntgenkopf und dem digitalen Sensor erstellt.

Entnahme von Proben der Zahnspaltenflüssigkeit Die periimplantäre Zahnspaltenflüssigkeit (PICF) wurde an der mesial-bukkalen Stelle des neu restaurierten Studienimplantats entnommen, während die gingivale Zahnspaltenflüssigkeit (GCF) an der mesial-bukkalen Stelle eines kontralateralen Kontrollzahns bei T0 entnommen wurde und T1. Vor der PICF/GCF-Sammlung wurden die Oberflächen sanft an der Luft getrocknet und durch Auflegen von Watterollen und Verwendung eines Speichelsaugers vom Speichel isoliert. Anschließend wurde die supragingivale Plaque vorsichtig mit sterilen Küretten entfernt und Papierstreifen (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) vorsichtig auf der mesialen Seite des periimplantären/gingivalen Sulkus platziert, bis ein leichter Widerstand zu spüren war, und 30 Sekunden lang gehalten Sek. Bei der Platzierung der Streifen wurde darauf geachtet, mechanische Verletzungen zu vermeiden, und mit Blut kontaminierte Streifen wurden entsorgt. Die Streifen wurden bis zur weiteren Verarbeitung in Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei -80 °C gelagert.

Proteomische Analyse von Taschenflüssigkeitsproben (PICF/GCF) Die PICF- und GCF-Proben, die an den Implantationsstellen der Studie (n=10) und den Kontrollzahnstellen (n=10) zum Zeitpunkt T0 bzw. T1 gesammelt wurden, wurden gepoolt und für die Proteomanalyse verwendet . Kurz gesagt, 20 µg Gesamtprotein pro gepoolter Probe wurden reduziert, alkyliert, trypsiniert und mit einer Eintopf-Festphasen-verstärkten Probenvorbereitung (SP3) gereinigt, die den Proteinverdau unter Verwendung des SP3-iST von PreOmics (PreOmics GmbH) unterstützte das Herstellungsprotokoll für die Proteinextraktion und -verdauung. Diese Extrakte wurden mit einem Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) konzentriert und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.

Die verdauten Proben wurden zunächst mit 30 µl 3 % Acetonitril (ACN) in 0,1 % Ameisensäure rekonstituiert und dann einem Fusion Orbitrap Lumos-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) unterzogen, das an ein Easy Nano-Flow-HPLC-System (Thermo Fisher Scientific) für Proteomik angeschlossen war Analyse. Während der Proteomikanalyse wurde ein Dreiliniengradient aus Acetonitril und Wasser mit 0,1 % Ameisensäure bei einer Flussrate von 300 nL/Minute verwendet. Der Gradient stieg innerhalb von 60 Minuten von 2 % auf 30 % Acetonitril, dann innerhalb von 10 Minuten von 30 % auf 97 % Acetonitril und wurde schließlich 10 Minuten lang bei 97 % Acetonitril gehalten. Das Massenspektrometer wurde so eingestellt, dass es datenabhängig arbeitet und mithilfe des Xcalibur-Softwarepakets von Thermo Fisher Scientific automatisch zwischen MS und MS/MS umschaltet. Für den Orbitrap-Analysator wurde ein Massenbereich von 300–1500 m/z ausgewählt.

Die erfassten MS-Daten wurden mit dem Mascot (Version 2.4.1, Matrix Science)-Suchmaschine gegen eine interne Datenbank mit 10.125.458 Einträgen, die menschliche (abgerufen am 22. Februar 2022 von Uniprot) und bakterielle (abgerufen am 22. Februar 2022 von eHOMD) Proteine, häufige MS-Kontaminanten und umgekehrte Sequenzen zur Abschätzung der Falscherkennungsrate. Während der Proteomikanalyse wurden die Vorläuferionentoleranz und die Fragmentionentoleranz auf 10 ppm bzw. ±0,6 Da eingestellt. Für den tryptischen Verdau wurden bis zu zwei fehlende Spaltungen pro Peptid zugelassen. Die Carbamidomethylierungsmodifikation an Cystein wurde als feste Modifikation ausgewählt, während die Desamidierung von Asparagin und Glutamin sowie die Oxidation von Methionin als variable Modifikationsparameter ausgewählt wurden.

Die Spektrenberichte der Suchergebnisse wurden mit der Scaffold-Software (Version 4.2.1, Proteome-Software) erstellt, und Proteine ​​mit einem FDR von 1 %, mindestens 2 identifizierten eindeutigen Peptiden, sowie Peptid-FDR von 0,1 % wurden für die Analyse der relativen Proteinhäufigkeit verwendet. Faltenänderungen in der Häufigkeitsintensität wurden basierend auf dem Wert log2 Fold Change (FC) zwischen Paaren aufeinanderfolgender Zeitpunkte unter Verwendung von R-Software (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team) berechnet. Als reguliert galten Proteine ​​mit einem log2FC ≥ 1 eindeutiger Spektrumszählungen zwischen zwei Bedingungen oder ausschließlich identifiziert in einer Bedingung.

Bioinformatische Analyse der regulierten Proteine ​​Die regulierten Proteine ​​wurden mithilfe des Online-Tools WebGestalt einer Überrepräsentationsanalyse (ORA) anhand der Hallmark-Datenbank unterzogen. Ziel der am 25. März 2022 durchgeführten Analyse war es, die Regulation von Proteinen in Zähnen und Implantaten zwischen T0- und T1-Bedingungen zu vergleichen. In ähnlicher Weise untersuchte die Analyse am 29. März 2022 die Regulierung von Proteinen in Zähnen und Implantaten entweder unter den T0- oder T1-Bedingungen. Es wurden die zehn besten angereicherten Ergebnisse, geordnet nach p-Wert unter Verwendung der hypergeometrischen Verteilung, gemeldet. Allerdings wurden nur Pfade mit einem p-Wert < 0,05 als reguliert angesehen.