Proteomische analyse van nieuw gerestaureerde enkele implantaten

Onderzoekspopulatie Tussen december 2018 en november 2019 werden in totaal 10 systemisch gezonde niet-rokers gerekruteerd, die eerder werden behandeld voor parodontitis en implantaattherapie kregen. Elke proefpersoon droeg bij met een nieuw hersteld, met schroeven vastgezet implantaat 2-4 weken na functionele belasting (basislijn, T0) en werd gedurende 12 maanden (T1) nauwlettend gevolgd. Alle onderzoeksimplantaten waren platformgeschakeld (ø4,1. Straumann® Bone Level) en werden geïnstalleerd volgens een chirurgisch plaatsingsprotocol in twee fasen. Een contralaterale tand in dezelfde kaak, maar in het tegenovergestelde kwadrant, diende als controle. De plaatsing van het implantaat werd gepland op basis van klinische en computertomografische evaluaties met kegelbundels en werd uitgevoerd met behulp van een prothetische gids. De implantaten werden ondergedompeld en zes maanden later blootgelegd, waarna een genezend abutment op de armatuur werd aangebracht, gevolgd door een met schroeven vastgezette kroon een maand later. Uitsluitingscriteria omvatten jonger dan 18 jaar, <18 tanden (exclusief derde kiezen), onbehandelde parodontitis, parodontitis stadium III-IV, bewijs van peri-implantitis (Berglundh et al, 2018) op andere implantatieplaatsen, significante pathologie van zacht weefsel onbehandelde carieuze gaatjes (vijf of meer), systemische ziekten die de inname van medicijnen vereisen, medische aandoeningen die de plaatsing van chirurgische implantaten gecontra-indiceerd hebben, de medicatie die het botmetabolisme verstoort, zwangerschap of borstvoeding, inadequate afmetingen van de alveolaire rand of getransplanteerd bot bij de operatie plaats en tandextractie 3 maanden voorafgaand aan het onderzoek, roken.

Klinische beoordelingen Locatiespecifieke en volledige mond klinische indexen werden beoordeeld op T0 en T1. Instructies voor mondhygiëne met behulp van een handtandenborstel en de aangepaste Bass-techniek werden herhaald op vier tijdstippen gedurende de onderzoeksperiode van 12 maanden (T0, 3-, 6-maanden en T1). Profylaxe bestaande uit supragingivaal ultrasoon debridement en polijsten met een rubberen cup werd op dezelfde tijdstippen uitgevoerd. In detail zijn de volgende locatiespecifieke klinische indices voor het onderzoeken van de pocketdiepte (PPD), klinische hechtingsniveaus (CAL), recessie (REC), gemodificeerde gingivale index (MGI) (scorebereik 0-4) (Lobene et al. 1986), gemodificeerde tandplakindex (mPI)1 (scorebereik: 0-3) en gemodificeerde sulcusbloedingsindex (mBI)1 (scorebereik: 0-3) werden op vergelijkbare wijze als PPD bepaald op de mesiale buccale plaats van het onderzoeksimplantaat CAL, REC, MGI, plaque-index (PI)2 (scorebereik: 0-3) en sulcusbloedingsindex (SBI)3 (scorebereik: 0-5) op de controletandplaats. De breedte van het verhoornde weefsel (KTW) werd bepaald ter hoogte van het middenbuccale aspect van de testimplantaat/controletand. Bovendien werden op basis van de volledige mond PPD, CAL en dichotome supragingivale tandplak (PI) (O'Leary et al., 1972) en bloeding bij sonderen (BOP) (Ainamo et al., 1975) geregistreerd op zes locaties per keer. tand/implantaat aanwezig in de mond. Parodontale klinische indices werden bepaald met behulp van een handmatige parodontale sonde (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23 / QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, VS) tot op de dichtstbijzijnde millimeter.

Radiografisch onderzoek De VixWin™ Platinum Gendex-software (Hatfield, PA, VS) beoordeelde lineair de afstand tussen het implantaatplatform en de botkam (I-BC) parallel aan de lange as van de implantaatbevestiging op T0 en T1 op intra-orale digitale röntgenfoto's. Periapicale digitale röntgenfoto's (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Parijs, Frankrijk) werden verkregen met behulp van de lange kegel-paralleltechniek op een afstand van 10 cm tussen de röntgenkop en de digitale sensor.

Verzameling van monsters van creviculair vocht Peri-implantaat creviculair vocht (PICF) werd verzameld uit de mesiaal-buccale plaats van het onlangs herstelde onderzoeksimplantaat, terwijl gingivaal creviculair vocht (GCF) werd verzameld uit de mesiaal-buccaal plaats van een contralaterale controletand op T0. en T1. Vóór de PICF/GCF-verzameling werden de oppervlakken voorzichtig aan de lucht gedroogd en geïsoleerd van speeksel door wattenrolletjes te plaatsen en een speekselzuiger te gebruiken. Vervolgens werd supragingivale plaque voorzichtig verwijderd door steriele curettes en werden papieren strips (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, VS) voorzichtig in het mesiale aspect van de peri-implantaat/gingivale sulcus geplaatst totdat milde weerstand werd gevoeld en gedurende 30 uur werd vastgehouden. sec. Er werd voor gezorgd dat mechanisch trauma werd vermeden bij het plaatsen van de strips, en de met bloed verontreinigde strips werden weggegooid. De strips werden bij -80°C bewaard in Eppendorf-buizen (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) totdat ze verder werden verwerkt.

Proteomische analyse van creviculaire vloeistofmonsters (PICF/GCF) De PICF- en GCF-monsters verzameld op de implantatieplaatsen van het onderzoek (n=10) en de controletandplaatsen (n=10), respectievelijk op T0 en T1, werden samengevoegd en gebruikt voor proteomische analyse . In het kort werd 20 μg totaal eiwit per samengevoegd monster gereduceerd, gealkyleerd, getrypsiniseerd en gezuiverd met een enkele pot, solid-phase-enhanced monstervoorbereiding (SP3) ondersteunde eiwitvertering met behulp van de SP3-iST van PreOmics (PreOmics GmbH) na het productieprotocol voor eiwitextractie en -vertering. Deze extracten werden geconcentreerd met behulp van een Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, VS) en tot verder gebruik bij -20 ° C bewaard.

De gedigereerde monsters werden eerst gereconstitueerd met 30 µl 3% acetonitril (ACN) in 0,1% mierenzuur en vervolgens onderworpen aan Fusion Orbitrap Lumos massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) gekoppeld aan een Easy nano-flow HPLC-systeem (Thermo Fisher Scientific) voor proteomics analyse. Tijdens proteomics-analyse werd een drielaagse gradiënt van acetonitril en water gebruikt met 0,1% mierenzuur bij een stroomsnelheid van 300 nL/minuut. De gradiënt verliep van 2% naar 30% acetonitril in 60 minuten, vervolgens van 30% naar 97% acetonitril in 10 minuten en werd uiteindelijk gedurende 10 minuten op 97% acetonitril gehouden. De massaspectrometer werd ingesteld om data-afhankelijk te werken en automatisch te schakelen tussen MS en MS/MS met behulp van het Xcalibur-softwarepakket van Thermo Fisher Scientific. Voor de Orbitrap-analysator werd een massabereik van 300-1500 m/z geselecteerd.

De verkregen MS-gegevens werden verwerkt met behulp van de Mascot (versie 2.4.1, Matrix Science) zoekmachine tegen een interne database met 10.125.458 vermeldingen, waaronder menselijke (geraadpleegd op 22 februari 2022 via Uniprot) en bacteriële (geraadpleegd op 22 februari 2022 via eHOMD) eiwitten, veel voorkomende MS-verontreinigingen en omgekeerde sequenties voor het schatten van de percentage valse ontdekkingen. Tijdens de proteomics-analyse werden de tolerantie voor precursorionen en fragmentionentolerantie ingesteld op respectievelijk 10 ppm en ± 0,6 Da. Voor tryptische vertering waren maximaal twee gemiste splitsingen per peptide toegestaan. De carbamidomethyleringsmodificatie op cysteïne werd geselecteerd als een vaste modificatie, terwijl deamidatie van asparagine en glutamine en oxidatie van methionine werden gekozen als variabele modificatieparameters.

De spectrumrapporten van de zoekresultaten werden gegenereerd met behulp van Scaffold-software (versie 4.2.1, Proteome-software) en eiwitten met FDR van 1%, minimaal 2 unieke peptiden geïdentificeerd, aangezien peptide FDR van 0,1% werd gebruikt voor analyse van de relatieve eiwitabundantie. Vouwveranderingen in overvloedintensiteit werden berekend op basis van waarde log2 vouwverandering (FC) tussen paren opeenvolgende tijdstippen met behulp van R-software (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Eiwitten met een log2FC ≥ 1 unieke spectrumtellingen tussen twee aandoeningen of uitsluitend geïdentificeerd in één aandoening werden als gereguleerd beschouwd.

Bio-informatica-analyse voor de gereguleerde eiwitten De gereguleerde eiwitten ondergingen een overrepresentatieanalyse (ORA) tegen de Hallmark-database met behulp van de online tool WebGestalt. De analyse, uitgevoerd op 25 maart 2022, had tot doel de regulatie van eiwitten in tanden en implantaten tussen T0- en T1-omstandigheden te vergelijken. Op dezelfde manier onderzocht de analyse op 29 maart 2022 de regulatie van eiwitten in zowel tanden als implantaten onder de T0- of T1-omstandigheden. De top 10 verrijkte resultaten, gerangschikt op p-waarde met behulp van de hypergeometrische verdeling, werden gerapporteerd. Alleen routes met een p-waarde < 0,05 werden echter als gereguleerd beschouwd.