Proteomisk analyse av nylig restaurerte enkeltimplantater

Studiepopulasjon Totalt 10 systemisk friske ikke-røykere, som tidligere ble behandlet for periodontal sykdom og fikk implantatbehandling, ble rekruttert mellom desember 2018 og november 2019. Hvert forsøksperson bidro med et nylig restaurert skruebeholdt implantat 2-4 uker etter funksjonell belastning (baseline, T0) og ble fulgt nøye over 12 måneder (T1). Alle studieimplantater ble plattformbyttet (ø4.1. Straumann® Bone Level) og ble installert etter en to-trinns kirurgisk plasseringsprotokoll. En kontralateral tann i samme kjeve, men på motsatt kvadrant, fungerte som kontroll. Implantatplassering ble planlagt basert på kliniske og kjeglestråledatastyrte tomografievalueringer og ble utført ved hjelp av en proteseguide. Implantater ble nedsenket og ble eksponert 6 måneder senere da et helbredende abutment ble justert på fiksturen etterfulgt av en skruebeholdt krone 1 måned senere. Eksklusjonskriterier inkluderte yngre enn 18 år, <18 tenner (ekskludert tredje molarer), ubehandlet periodontal sykdom, periodontitt Stadium III-IV, tegn på peri-implantitt (Berglundh et al, 2018) på andre implantatsteder, betydelig bløtvevspatologi , ubehandlede karieshuler (fem eller flere), systemiske sykdommer som krever inntak av medisiner, medisinske tilstander som kontraindiserte kirurgisk implantatplassering, medisinen som forstyrrer benmetabolismen, graviditet eller amming, utilstrekkelige dimensjoner av alveolarryggen eller podet bein ved operasjonen sted, og tannekstraksjon 3 måneder før studien, røyking.

Kliniske vurderinger Stedspesifikke og kliniske indekser i full munn ble vurdert ved T0 og T1. Munnhygieneinstruksjoner ved bruk av en manuell tannbørste og den modifiserte Bass-teknikken ble gjentatt på fire tidspunkter i løpet av den 12-måneders studieperioden (T0, 3-, 6-måneder og T1). Profylakse omfattende supragingival ultralyddebridering og polering med en gummikopp ble utført på samme tidspunkt. I detalj, de følgende stedsspesifikke kliniske indeksene som sonderer lommedybde (PPD), kliniske tilknytningsnivåer (CAL), resesjon (REC), modifisert gingivalindeks (MGI) (poengområde 0-4) (Lobene et al. 1986), modifisert dental plakkindeks (mPI)1 (poengområde: 0-3) og modifisert sulcus blødningsindeks (mBI)1 (poengområde: 0-3) ble bestemt på det mesiale bukkalstedet til studieimplantatet på lignende måte som PPD , CAL, REC, MGI, plakkindeks (PI)2 (scoreområde: 0-3) og sulcus blødningsindeks (SBI)3 (poengområde: 0-5) på kontrolltannstedet. Bredden av keratinisert vev (KTW) ble bestemt ved det midtbukkale aspektet av test-implantat/kontrolltannen. Dessuten ble PPD, CAL og dikotom supragingival dental plakk (PI) (O'Leary et al., 1972) og blødning ved sondering (BOP) (Ainamo et al., 1975) registrert på seks steder pr. tann/implantat tilstede i munnen. Periodontale kliniske indekser ble bestemt ved bruk av en manuell periodontal probe (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) til nærmeste millimeter.

Radiografisk undersøkelse VixWin™ Platinum Gendex-programvaren (Hatfield, PA, USA) vurderte lineært avstanden mellom implantatplattformen og benkammen (I-BC) parallelt med langaksen til implantatfiksturen ved T0 og T1 på intra-oral digital røntgenbilder. Periapikale digitale røntgenbilder (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, Frankrike) ble oppnådd ved bruk av den lange kjegleparallelle teknikken i en avstand på 10 cm mellom røntgenhodet og den digitale sensoren.

Innsamling av crevicular væskeprøver Peri-implantat crevicular fluid (PICF) ble samlet fra det mesial-bukkale stedet til det nylig restaurerte studieimplantatet, mens gingival crevicular fluid (GCF) ble samlet fra det mesial-bukkale stedet til en kontralateral kontrolltann ved T0 og T1. Før PICF/GCF-samling ble overflatene forsiktig lufttørket og isolert fra spytt ved å plassere bomullsruller og bruke en spyttutkaster. Deretter ble supragingival plakk forsiktig fjernet med sterile kyretter og papirstrimler (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) ble forsiktig plassert i det mesiale aspektet av peri-implantat/gingival sulcus inntil mild motstand ble kjent og holdt i 30 sek. Det ble tatt hensyn til å unngå mekaniske traumer ved plassering av stripene, og de stripene som var forurenset med blod ble kastet. Strimlene ble lagret i Eppendorf-rør (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved -80C inntil videre bearbeiding.

Proteomisk analyse av crevicular væskeprøver (PICF/GCF) PICF- og GCF-prøvene samlet inn fra studiens implantatsteder (n=10) og kontrolltannstedene (n=10), henholdsvis ved T0 og T1, ble samlet og brukt til proteomikkanalyse . Kort oppsummert ble 20 µg totalt protein per samlet prøve redusert, alkylert, trypsinisert og renset med enkeltpotte, fastfase-forsterket prøvepreparat (SP3) assistert proteinfordøyelse ved bruk av PreOmics' SP3-iST (PreOmics GmbH) følgende produksjonsprotokollen for proteinekstraksjon og fordøyelse. Disse ekstraktene ble konsentrert ved bruk av en Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og lagret ved -20 °C inntil videre bruk.

De fordøyde prøvene ble først rekonstituert med 30 µL 3 % acetonitril (ACN) i 0,1 % maursyre og deretter utsatt for Fusion Orbitrap Lumos massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) koblet til et Easy nano-flow HPLC-system (Thermo Fisher Scientific) for proteomikk analyse. Under proteomikkanalyse ble en tre-foringsgradient av acetonitril og vann brukt med 0,1 % maursyre ved en strømningshastighet på 300 nL/minutt. Gradienten utviklet seg fra 2 % til 30 % acetonitril i løpet av 60 minutter, deretter fra 30 % til 97 % acetonitril på 10 minutter, og holdt til slutt på 97 % acetonitril i 10 minutter. Massespektrometeret ble satt til å fungere på en dataavhengig måte, og byttet automatisk mellom MS og MS/MS ved hjelp av Xcalibur-programvarepakken fra Thermo Fisher Scientific. Et masseområde på 300-1500 m/z ble valgt for Orbitrap-analysatoren.

De innhentede MS-dataene ble behandlet ved hjelp av Mascot (versjon 2.4.1, Matrix Science) søkemotor mot en intern database som inneholder 10 125 458 oppføringer, som inkluderte menneskelige (åpnet 22. februar 2022 fra Uniprot) og bakterielle (åpnet 22. februar 2022 fra eHOMD) proteiner, vanlige MS-forurensninger og omvendte sekvenser for å estimere falsk oppdagelsesrate. Under proteomikkanalysen ble forløperiontoleransen og fragmentiontoleransen satt til henholdsvis 10 ppm og ±0,6 Da. Opptil to glemte spaltninger per peptid ble tillatt for tryptisk fordøyelse. Karbamidometyleringsmodifikasjonen på cystein ble valgt som en fast modifikasjon, mens deamidering av asparagin og glutamin og oksidasjon av metionin ble valgt som variable modifikasjonsparametere.

Spektrumrapportene for søkeresultatene ble generert ved bruk av Scaffold-programvare (versjon 4.2.1, Proteome-programvare), og proteiner med FDR ved 1 %, minimalt med 2 unike peptider identifisert, som peptid-FDR ved 0,1 % ble brukt for relativ proteinoverflodsanalyse. Foldeendringer i overflodsintensitet ble beregnet basert på verdi log2 fold endring (FC) mellom par av påfølgende tidspunkt ved bruk av R-programvare (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Proteiner med en log2FC ≥ 1 av unike spektrumtellinger mellom to tilstander eller utelukkende identifisert i en tilstand ble ansett som regulert.

Bioinformatikkanalyse for de regulerte proteinene. De regulerte proteinene gjennomgikk overrepresentasjonsanalyse (ORA) mot Hallmark-databasen ved bruk av nettverktøyet WebGestalt. Analysen, utført 25. mars 2022, hadde som mål å sammenligne reguleringen av proteiner i tenner og implantater mellom T0- og T1-tilstander. På samme måte, 29. mars 2022, undersøkte analysen reguleringen av proteiner i både tenner og implantater under enten T0- eller T1-forholdene. De 10 beste berikede resultatene, rangert etter p-verdi ved bruk av den hypergeometriske fordelingen, ble rapportert. Det var imidlertid kun veier med p-verdi < 0,05 som ble vurdert som regulert.