Analisi proteomica di impianti singoli appena restaurati

Popolazione dello studio Tra dicembre 2018 e novembre 2019 sono stati reclutati un totale di 10 non fumatori sistemicamente sani, precedentemente trattati per la malattia parodontale e sottoposti a terapia implantare. Ciascun soggetto ha contribuito con un impianto avvitato appena restaurato 2-4 settimane dopo il carico funzionale (baseline, T0) ed è stato seguito attentamente per 12 mesi (T1). Tutti gli impianti dello studio erano sottoposti a cambio di piattaforma (ø4.1. Straumann® Bone Level) e sono stati installati seguendo un protocollo di posizionamento chirurgico in due fasi. Un dente controlaterale nella stessa mascella, ma nel quadrante opposto, fungeva da controllo. Il posizionamento dell'impianto è stato pianificato sulla base di valutazioni cliniche e di tomografia computerizzata a fascio conico ed è stato eseguito utilizzando una guida protesica. Gli impianti sono stati sommersi e sono stati esposti 6 mesi dopo, quando una componente secondaria di guarigione è stata adattata all'impianto, seguita da una corona avvitata 1 mese dopo. I criteri di esclusione includevano età inferiore a 18 anni, <18 denti (esclusi i terzi molari), malattia parodontale non trattata, parodontite stadio III-IV, evidenza di perimplantite (Berglundh et al, 2018) in altri siti implantari, patologia significativa dei tessuti molli , cavità cariate non trattate (cinque o più), malattie sistemiche che richiedono l'assunzione di farmaci, condizioni mediche che controindicano il posizionamento dell'impianto chirurgico, farmaci che interferiscono con il metabolismo osseo, gravidanza o allattamento, dimensioni inadeguate della cresta alveolare o dell'osso innestato nel sito chirurgico sito ed estrazione del dente 3 mesi prima dello studio, fumo.

Valutazioni cliniche Gli indici clinici sito-specifici e dell'intera bocca sono stati valutati a T0 e T1. Le istruzioni di igiene orale utilizzando uno spazzolino manuale e la tecnica di Bass modificata sono state ripetute in quattro punti temporali nel corso del periodo di studio di 12 mesi (T0, 3, 6 mesi e T1). Negli stessi momenti è stata effettuata la profilassi comprendente lo sbrigliamento ultrasonico sopragengivale e la lucidatura con una coppetta di gomma. Nel dettaglio, i seguenti indici clinici sito-specifici sondano la profondità delle tasche (PPD), i livelli di attacco clinico (CAL), la recessione (REC), l'indice gengivale modificato (MGI) (punteggio 0-4) (Lobene et al. 1986), l'indice modificato della placca dentale (mPI)1 (intervallo di punteggio: 0-3) e l'indice modificato di sanguinamento del solco (mBI)1 (intervallo di punteggio: 0-3) sono stati determinati nel sito mesio-vestibolare dell'impianto in studio in modo simile al PPD , CAL, REC, MGI, indice di placca (PI)2 (intervallo di punteggio: 0-3) e indice di sanguinamento del solco (SBI)3 (intervallo di punteggio: 0-5) nel sito del dente di controllo. La larghezza dei tessuti cheratinizzati (KTW) è stata determinata sull'aspetto medio-vestibolare del dente impianto test/controllo. Inoltre, su base totale, sono stati registrati PPD, CAL, placca dentale sopragengivale dicotomica (PI) (O'Leary et al., 1972) e sanguinamento al sondaggio (BOP) (Ainamo et al., 1975) in sei siti per dente/impianto presente in bocca. Gli indici clinici parodontali sono stati determinati utilizzando una sonda parodontale manuale (PCP-UNC 15; Hu-Friedy XP-23/QW, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) con una precisione al millimetro.

Esame radiografico Il software VixWin™ Platinum Gendex (Hatfield, PA, USA) ha valutato linearmente la distanza tra la piattaforma implantare e la cresta ossea (I-BC) parallela all'asse lungo dell'impianto implantare in T0 e T1 su digitale intraorale radiografie. Le radiografie digitali periapicali (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Parigi, Francia) sono state ottenute utilizzando la tecnica del parallelismo a cono lungo ad una distanza di 10 cm tra la testata radiografica e il sensore digitale.

Raccolta di campioni di fluido crevicolare Il fluido crevicolare peri-implantare (PICF) è stato raccolto dal sito mesio-buccale dell'impianto in studio appena restaurato, mentre il fluido crevicolare gengivale (GCF) è stato raccolto dal sito mesio-buccale di un dente di controllo controlaterale a T0 e T1. Prima della raccolta del PICF/GCF, le superfici sono state delicatamente asciugate all'aria e isolate dalla saliva posizionando rulli di cotone e utilizzando un aspirasaliva. Quindi, la placca sopragengivale è stata accuratamente rimossa mediante curette sterili e le strisce di carta (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) sono state posizionate delicatamente nell'aspetto mesiale del solco peri-implantare/gengivale finché non si è avvertita una leggera resistenza e mantenute per 30 sez. È stata prestata attenzione per evitare traumi meccanici durante il posizionamento delle strisce e quelle contaminate con sangue sono state scartate. Le strisce sono state conservate in provette Eppendorf (Eppendorf, Amburgo, Germania) a -80°C fino al successivo trattamento.

Analisi proteomica di campioni di fluido crevicolare (PICF/GCF) I campioni PICF e GCF raccolti dai siti implantari dello studio (n=10) e dai siti dei denti di controllo (n=10), rispettivamente a T0 e T1 sono stati raggruppati e utilizzati per l'analisi proteomica . In breve, 20 µg di proteine ​​totali per campione raggruppato sono stati ridotti, alchilati, trypsinizzati e purificati con la digestione proteica assistita da preparazione del campione in fase solida (SP3) a vaso singolo utilizzando SP3-iST di PreOmics (PreOmics GmbH) seguendo il protocollo di produzione per l'estrazione e la digestione delle proteine. Questi estratti sono stati concentrati utilizzando uno Speedvac (Thermo Savant SPD121P, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) e conservati a -20 °C fino a ulteriore utilizzo.

I campioni digeriti sono stati prima ricostituiti con 30 µl di acetonitrile (ACN) al 3% in acido formico allo 0,1%, quindi sottoposti allo spettrometro di massa Fusion Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific) interfacciato a un sistema HPLC Easy nano-flow (Thermo Fisher Scientific) per la proteomica analisi. Durante l'analisi proteomica, è stato utilizzato un gradiente a tre liner di acetonitrile e acqua con acido formico allo 0,1% a una portata di 300 nL/minuto. Il gradiente progrediva dal 2% al 30% di acetonitrile in 60 minuti, poi dal 30% al 97% di acetonitrile in 10 minuti, e infine si manteneva al 97% di acetonitrile per 10 minuti. Lo spettrometro di massa è stato impostato per funzionare in modo dipendente dai dati, passando automaticamente da MS a MS/MS utilizzando il pacchetto software Xcalibur di Thermo Fisher Scientific. Per l'analizzatore Orbitrap è stato selezionato un intervallo di massa di 300-1500 m/z.

I dati MS acquisiti sono stati elaborati utilizzando la mascotte (versione 2.4.1, Matrix Science) rispetto a un database interno contenente 10.125.458 voci, che includevano proteine ​​umane (accesso il 22 febbraio 2022 da Uniprot) e batteriche (accesso il 22 febbraio 2022 da eHOMD), contaminanti comuni della SM e sequenze inverse per la stima del tasso di false scoperte. Durante l'analisi proteomica, la tolleranza dello ione precursore e la tolleranza dello ione frammento sono state impostate rispettivamente su 10 ppm e ±0,6 Da. Per la digestione triptica sono state consentite fino a due scissioni mancate per peptide. La modificazione della carbamidometilazione sulla cisteina è stata selezionata come modificazione fissa, mentre la deammidazione di asparagina e glutammina e l'ossidazione della metionina sono state scelte come parametri di modificazione variabili.

I rapporti sullo spettro dei risultati della ricerca sono stati generati utilizzando il software Scaffold (versione 4.2.1, software Proteome) e le proteine ​​con FDR all'1%, sono stati identificati minimo 2 peptidi unici, poiché il peptide FDR allo 0,1% è stato utilizzato per l'analisi dell'abbondanza proteica relativa. Le variazioni di piega nell'intensità dell'abbondanza sono state calcolate in base al valore log2 fold change (FC) tra coppie di punti temporali consecutivi utilizzando il software R (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team). Le proteine ​​con un log2FC ≥ 1 di conteggi spettrali unici tra due condizioni o identificate esclusivamente in una condizione sono state considerate regolamentate.

Analisi bioinformatica per le proteine ​​regolate Le proteine ​​regolate sono state sottoposte ad analisi di sovrarappresentazione (ORA) rispetto al database Hallmark utilizzando lo strumento online WebGestalt. L'analisi, condotta il 25 marzo 2022, mirava a confrontare la regolazione delle proteine ​​nei denti e negli impianti tra le condizioni T0 e T1. Allo stesso modo, il 29 marzo 2022, l’analisi ha esaminato la regolazione delle proteine ​​sia nei denti che negli impianti in condizioni T0 o T1. Sono stati riportati i primi 10 risultati arricchiti, classificati in base al valore p utilizzando la distribuzione ipergeometrica. Tuttavia, solo i percorsi con un valore p <0,05 sono stati considerati regolamentati.