乳がん診断のための LINC00511/miR-185-3p 軸および miR-301a-3p マーカー

1. はじめに 1.1. 背景: 世界保健機関 (WHO) によると、乳がんは世界的に女性の主な死因の 1 つであり、2025 年のがん患者数は 1,930 万人になると予想されています。 エジプトでは、がん、特に乳がんが深刻な問題となっています[1]。

   乳がんは最も一般的な女性の悪性腫瘍であり、女性の健康に対する大きな脅威であり、その発症はかなり激しい局所浸潤、早期転移、化学療法に対する多剤耐性を伴います[2、3]。 したがって、乳がんの早期検出のための低侵襲マーカーの開発は非常に興味深いものとなっています。

   癌ゲノムアトラス (TCGA) は、癌で見つかった突然変異とコピー数変化の多くがタンパク質をコードする遺伝子と重複せず [4]、非コーディング DNA を含む非コーディング RNA 遺伝子に頻繁に位置していることを明らかにしました [5] 。 マイクロRNA (miRNA) は、がん、およびがんにおける治療標的またはバイオマーカーとしてのその役割が研究された最初の非コーディング RNA の 1 つです [6]。

   miRNA は短い一本鎖 RNA 配列 (通常 19 ～ 23 ヌクレオチド) であり、さまざまな生理学的および発生過程で遺伝子発現を制御するため、広範囲の生物学的システムにおける遺伝子発現の転写後制御において重要な役割を果たしています [7, 8]。 miRNA は、3'-UTR の相補配列との塩基対形成によって標的 mRNA の抑制を媒介し、転写物の不安定化、翻訳抑制、またはその両方を引き起こします [9]。 miRNA は、タンパク質をコードするエクソン [10] などの他の領域に結合することによって遺伝子発現も調節し、哺乳動物細胞で遺伝子発現を誘導することさえできることが報告されています [11]。

   無細胞循環 miRNA は通常、リボ核タンパク質複合体または高密度リポタンパク質に結合して存在するか、脂質小胞、微小小胞、エキソソームまたはアポトーシス小体の細胞から放出されます [12-15]。したがって、循環 miRNA は細胞の恒常性応答を反映している可能性があります。微生物だけでなく、病気の進行の兆候も検出します。 これらの miRNA は、その安定性と内因性 RNAse 活性に対する耐性により、癌を含む疾患の診断および予後バイオマーカーとして提案されています [16]。

   これらの miRNA のうち、MiR-185-3p はさまざまな種類の癌における腫瘍抑制遺伝子として同定されています。 miR-185-3p の発現は、乳がん細胞 MDA-MB-231 および MCF-7 で減少しました。 さらに、miR-185-3p は、LINC00511 サイレンシングトランスフェクションでは過剰発現されましたが、増強された LINC00511 プラスミドトランスフェクションでは減少しました [17]。

   MicroRNA-301a は、いくつかの種類の癌における腫瘍の進行に関連しているもう 1 つの oncomiR です。 たとえば、前立腺がん、胃がん、膵臓がんなどです [18-21]。 しかし、乳がんにおけるその役割は十分に研究されていません。

   長い非コード RNA (LncRNA) は 200 ヌクレオチドより長いもので、その多くは短い RNA を生成する一次転写物としても機能します。 一般に、LncRNA は、クロマチン量補償、インプリンティング、エピジェネティック制御、細胞周期制御、核および細胞質輸送、細胞分化などの遺伝子制御の役割に関与していると考えられています [22]。 さらに、一次転写物が LncRNA と相互作用し、最終的には異なる機能的スプライシング配列を形成するか、内因性低分子干渉 RNA、miRNA スポンジに分解されるプレ mRNA 相互作用、タンパク質活性または局在化の調節、およびリボタンパク質複合体形成の促進。 少なくとも、LncRNA は miRNA や piRNA のような小さなフラグメントの前駆体として機能します。 ciRNA の主な機能は、miRNA が相補的相互作用を通じて捕捉することであり、miRNA のスポンジのように機能します [23]。 LncRNA は、癌を含むヒトの病気にすでに関与していると考えられています [24]。

   長い遺伝子間非コーディング RNA 00511 (LINC00511);は、腫瘍のサイズ、転移、予後不良に影響を与える癌遺伝子です。 LINC00511はヒストンメチルトランスフェラーゼEZH2に結合し、p57上のヒストン修飾パターンを特定します[25]。 また、扁平上皮癌および膵管腺癌の癌遺伝子としても機能します [26]。 特に、LncRNA ががんの予後または診断のバイオマーカーとして機能するかどうかはほとんどわかっていません。 [27] 1.2. 問題: 乳がんの早期診断におけるこれらのバイオマーカーの役割はまだ調査されていません。

   1.3. 仮説: 乳がんの早期診断に使用される腫瘍抑制因子または発がん性バイオマーカーと LncRNA」

2. 作業の目的:

   この研究の最終的な目的は、感度と特異性の両方を測定することにより、乳房腫瘍の早期診断における LINC00511 と関連した miR-185-3p、miR-301a の機能のより明確な画像を提供することです。

3. 過去の研究結果: 半ページ。 研究されたバイオマーカーの診断上の有用性の側面については、これまでに臨床研究が行われたことはありません。

4. 問題文：

   エジプト患者の乳がん早期診断におけるこれらのバイオマーカーの役割はまだ調査されていません。

5. 研究の意義:

主な結果:

• 末梢血循環腫瘍抑制因子または発癌性低分子バイオマーカー乳癌を特定し、正常な対照発現と比較するため

二次的な結果:

• 診断マーカーとしてのタンパク質ベースのマーカー (CEA および CA15-3) と比較した miR-185-3p、miR-301a、および LINC00511 の感度と特異性を計算します。

6. 研究目的:

1. 原発性乳がんを診断するための最小限の非侵襲性分子マーカーとして、2 つの miRNA (miR-185-3p、miR-301a) とそれらの予測相互作用 lncRNA (LINC00511) の発現レベルを分析します。
2. 感度と特異性に関して、miR-185-3p、miR-301a、LINC00511 を診断マーカーとしてのタンパク質ベースのマーカー (CEA および CA15-3) と比較します。
3. miR-185-3p、miR-301a、LINC00511 と乳がんの臨床病理学的特徴との関係を研究します。
4. 研究方法：

この研究は、まずアイン・シャムス大学薬学部の倫理委員会とニューカイロ国立がん研究所の倫理委員会によって承認される予定です。 さらに、この実験はヘルシンキ宣言ガイドラインに従って実施され、2 つのグループが含まれ、すべての被験者がアーカイブに書面で同意することになります。

グループ 1 は対照グループです。合計 50 人の健康なボランティアは、病気に苦しんでいない、または服薬していない、年齢が一致した健康な女性ボランティアです。

グループ 2 (悪性乳房腫瘍): 非転移性原発性乳がんの女性 50 名。ニューカイロの国立がん研究所に通い、まだ化学療法や放射線療法を受けていない、最近診断された患者。

すべてのケースとコントロールについて完全な履歴が取得されます。 乳がん患者の年齢、閉経状態、病理組織型、腫瘍サイズ、リンパ節転移、腫瘍悪性度、さらにエストロゲン受容体（ER）とプロゲステロン受容体（PR）に関する特徴がデータ分析のために収集されます。

除外基準

以下の患者:

• 血液疾患、乳がん以外のがん
• 肝硬変、子宮および膀胱疾患

方法:

ルーティンワーク：

血液サンプリング:

血清調製のために、5 mlの血液を普通のバキュテナーチューブに採取します。 血清サンプルは、アインシャムス大学薬学部生化学部研究室で生化学的評価が行われるまで、-80 °C で保管されます。

定量 PCR による miR-185-3p、miR-301a、および LINC00511 のアッセイ:

miRNA および LncRNA は、Qiagen miRNeasy Mini Kit を使用してメーカーのプロトコールに従って血清から抽出され、その濃度と純度はナノドロップ分光光度計で検出されます。

濃縮された RNA は、メーカーのプロトコールに従って miroRNA または LncRNA 逆転写キットを使用して逆転写されます。

miRNA および LncRNA の発現は、ヒト MicroRNA および LncRNA アッセイ キットとそれらの特異的プライマーを使用した qRT-PCR によって定量されます。

調査された miRNA の発現レベルは、ΔCt 法 [28] を使用して評価されます。 サイクル閾値 (Ct) 値は、蛍光シグナルが特定の閾値を超えるのに必要な qPCR サイクル数です。 ΔCt は、それぞれ調査対象の miRNA および LncRNA の Ct 値から RNU6-2 および GAPDH の Ct 値を差し引くことによって計算されます。 ΔΔCt は、癌サンプルの ΔCt から対照サンプルの ΔCt を引くことによって計算されます。

ホルモン受容体およびタンパク質ベースの腫瘍マーカーの検査:CEA および CA15.3 腫瘍マーカーに加えて、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ヒト上皮成長因子受容体 2 (HER-2neu) の両方を、ELISA キットを使用して国立がん研究所から入手します。 、ニューカイロ。

サンプルサイズの推定 この研究の目的は、実験対象ごとに 1 人の対照を使用して、独立した対照および乳がん症例から得た一部の循環 MiRNA の役割を調査することです。 以前の研究 (Hu et al. 2012) に基づいて、発癌性の小さなバイオマーカーの発現は、標準偏差 2.9 および大きな効果サイズ (1.09) で正規分布していました。 乳がん群と対照群の平均値の真の差が 2.25 である場合、実験群と対照群の母平均が確率的に等しいという帰無仮説を棄却するには、25 人の実験被験者と 25 人の対照被験者を研究する必要があります (パワー）0.8。 この帰無仮説の検定に関連するタイプ I の過誤確率は 0.05 です。

腫瘍抑制因子の発現平均に関しては、大きな効果量 (1.4) で正規分布しました。 乳がん群と対照群の平均値の真の差が 14 である場合、実験群と対照群の母平均が確率的に等しいという帰無仮説を棄却するには、15 人の実験被験者と 15 人の対照被験者を研究する必要があります (パワー）0.8。 この帰無仮説の検定に関連するタイプ I の過誤確率は 0.05 です。

サンプルの合計サイズは 80 件で、この数は予想される損失に対して 25% 増加します。サンプルの合計は 100 人の被験者、各グループあたり 50 人の被験者です。

サンプル サイズの推定は、G power* サンプル サイズ計算機によって実行されました。

統計分析：

統計分析の実行には、SPSS 21.0 ソフトウェア パッケージ (SPSS、イリノイ州シカゴ) が使用されます。 必要に応じて、T 検定またはマン-ホイットニーの U 検定を使用して、2 つのグループの連続変数の差を比較します。 カテゴリ変数の違いを比較するには、ピアソンのカイ二乗分析またはフィッシャーの直接確率検定が使用されます。 受信者動作特性 (ROC) 曲線と ROC 曲線下面積 (AUC) をプロットして、がん群と非がん群を区別する最適なカットオフ ポイントを決定します。 miRNA とその診断有効性について感度と特異性が計算されます。すべての分析において、両側 P 値が 0.05 以下であると統計的に有意であるとみなされます。

5. 研究時間計画/フレーム i. タイムプラン Q/年 アクション Q1 サンプル収集、データ収集、倫理承認のための公式文書の準備、対照と患者のサンプルサイズの計算 Q2 選択した基準に従って患者からサンプルを収集し、アリコート中の血清を分離する Q3 サンプル収集と血清の分離を継続する血清のアリコート + サンプルからの RNA の抽出 Q4 対照サンプルの収集と RNA の抽出 Q1 全サンプルの cDNA 合成 + qPCR Q2 データの統計解析と論文執筆の開始 + 論文執筆のための関連論文の収集 Q3 論文の出版論文の執筆と改訂に向けた論文の仕上げ

ii.論文タイトル: 「乳がんにおける LncRNA と関連した腫瘍抑制因子または発がん性小型バイオマーカーの診断的有用性」

著者:

マルワ・M・モハメド、エマン・フアド・サナド博士、レハム・アリ・アッバス・エル・シミ博士、ナディア・M・ハムディ。

対応著者: Nadia M. Hamdy 教授 最初の著者: Marwa M. Mohamed 寄稿者: Eman Fouad Sanad 博士、Reham Ali Abbas El-Shimy 博士

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