LINC00511/miR-185-3p Axis og miR-301a-3p Markører for brystkreftdiagnose

1. Innledning 1.1. Bakgrunn: Brystkreft er en av de viktigste dødsårsakene for kvinner globalt, ifølge verdens helseorganisasjon (WHO) vil antallet krefttilfeller som forventes i 2025 være 19,3 millioner tilfeller. I Egypt er kreft et økende problem og spesielt brystkreft [1].

   Brystkreft er den vanligste kvinnelige ondartede svulsten og en stor trussel mot kvinners helse og utviklingen er betydelig aggressiv lokal invasjon, tidlige metastaser og multimedikamentresistens mot kjemoterapi [2, 3]. Derfor er utviklingen av minimalt-invasive markører for tidlig oppdagelse av brystkreft av stor interesse.

   Kreftgenomet Atlas (TCGA) avslørte at mange av mutasjonene og kopiantallsendringene funnet i kreft ikke overlapper med proteinkodende gener [4], men er ofte lokalisert i ikke-kodende DNA-inkludert ikke-kodende RNA-gener [5] . MikroRNA (miRNA) var blant de første ikke-kodende RNAene som ble undersøkt kreft, og deres roller som terapeutiske mål eller biomarkører i kreft [6].

   MiRNA er korte, enkelttrådede RNA-sekvenser (vanligvis 19-23 nukleotider) som kontrollerer genuttrykk i en rekke fysiologiske og utviklingsmessige prosesser, og har dermed en kritisk rolle i posttranskripsjonell regulering av genuttrykk i et bredt spekter av biologiske systemer [7, 8]. MiRNA medierer undertrykkelsen av mål-mRNA ved baseparing til komplementær sekvens i 3'-UTR, noe som forårsaker transkripsjonsdestabilisering, translasjonsundertrykkelse eller begge deler [9]. Det har blitt rapportert at miRNA også modulerer genuttrykk ved å binde seg til andre regioner, inkludert proteinkodende eksoner [10], og kan til og med indusere genuttrykk i pattedyrceller [11].

   Cellefrie sirkulerende miRNA-er eksisterer vanligvis bundet til ribonukleoprotienkomplekser eller lipoprotein med høy tetthet, eller de frigjøres fra celler i lipidvesikler, mikrovesikler, eksosomer eller apoptotiske legemer [12-15]. Dermed kan sirkulerende miRNA-er reflektere homeostatisk respons fra organisme, samt tegn på sykdomsprogresjon. På grunn av deres stabilitet og motstand mot endogen RNAse-aktivitet, har disse miRNA-ene blitt foreslått som diagnostiske og prognostiske biomarkører for sykdommer, inkludert kreft [16].

   Blant disse miRNAene har MiR-185-3p blitt identifisert som et tumorsuppressorgen i ulike typer kreft. Ekspresjonen av miR-185-3p ble redusert i brystkreftcellene MDA-MB-231 og MCF-7. Dessuten ble miR-185-3p overuttrykt i den LINC00511-dempede transfeksjonen, mens den ble redusert i den forbedrede LINC00511-plasmidtransfeksjonen [17].

   MicroRNA-301a er en annen oncomiR som har vært relatert til tumorprogresjon i flere typer kreft. For eksempel ved prostatakreft, magekreft samt kreft i bukspyttkjertelen [18-21]. Imidlertid er dens rolle i brystkreft ikke fullt ut undersøkt.

   Lange ikke-kodende RNA (LncRNA) er de som er lengre enn 200 nukleotider, og mange av dem kan også fungere som primære transkripsjoner for å produsere korte RNA. Generelt har LncRNA-er blitt implisert i genregulerende roller, slik som kromatindosekompensasjon, imprinting, epigenetisk regulering, cellesykluskontroll, kjernefysisk og cytoplasmatisk handel og celledifferensiering [22]. Videre pre-mRNA interaksjon hvor det primære transkriptet interagerer med LncRNA og ender opp med en annen funksjonell spleiset sekvens eller degraderes til endogene små interfererende RNAer, miRNA svamper, modulering av proteinaktivitet eller lokalisering og tilrettelegging av riboproteinkompleksdannelse. Ikke i det minste kan LncRNA stå som forløpere for mindre fragmenter som miRNA eller piRNA. Hovedfunksjonen til ciRNA-er består i at miRNA-er fanger opp gjennom komplementære interaksjoner, og fungerer som en miRNA-svamp [23]. LncRNA-er har allerede vært implisert i menneskelig sykdom inkludert kreft [24].

   Langt intergenisk ikke-kodende RNA 00511 (LINC00511); er et onkogen som påvirker tumorstørrelse, metastaser og dårlig prognose. LINC00511 binder histonmetyltransferase EZH2 og spesifiserer histonmodifikasjonsmønsteret på p57 [25]. Det fungerer også som et onkogen ved plateepitelkarsinom og duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen [26]. Spesielt er lite kjent om LncRNA kan tjene som biomarkører for kreftprognose eller diagnose. [27] 1.2. Problem: Rollen til disse biomarkørene er ennå ikke undersøkt i tidlig diagnose av brystkreft.

   1.3. Hypotese: Tumor suppressor eller onkogene biomarkører og LncRNA brukt i tidlig diagnose av brystkreft"

2. Målet med arbeidet:

   Det endelige målet med arbeidet er å gi et klarere bilde av funksjonene til miR-185-3p, miR-301a, i forbindelse med LINC00511 i tidlig diagnose av brystsvulster med måling av både sensitivitet og spesifisitet.

3. Tidligere studier Funn: på halv side. Det ble ikke gjort noen tidligere kliniske studier på aspektet ved de diagnostiske verktøyene til de studerte biomarkørene.

4. Problemstilling:

   Rollen til disse biomarkørene er ennå ikke undersøkt i tidlig diagnose av brystkreft hos egyptiske pasienter.

5. Forskningsbetydning:

Primært resultat:

• For å identifisere perifer blodsirkulerende tumorsuppressor eller onkogene små biomarkører brystkreft og sammenligne med normalt kontrolluttrykk

Sekundært resultat:

• For å beregne sensitivitet og spesifisitet til miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 sammenlignet med de proteinbaserte markørene (CEA og CA15-3) som diagnostiske markører.

6. Forskningsmål:

1. Analyser ekspresjonsnivået til to miRNA (miR-185-3p, miR-301a) og deres forutsagte interagerte lncRNA (LINC00511) som minimale ikke-invasive molekylære markører for diagnostisering av primær brystkreft.
2. Sammenlign miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 med de proteinbaserte markørene (CEA og CA15-3) som diagnostiske markører, med hensyn til sensitivitet og spesifisitet.
3. Studer forholdet mellom miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 og de klinisk-patologiske karakterene til brystkreft.
4. Forskningsmetodikk:

Denne studien vil først bli godkjent av den etiske komiteen ved det farmasøytiske fakultet, Ain Shams University og av den etiske komiteen ved National Cancer Institute, New Cairo. Dessuten vil det bli utført i samsvar med Helsinki-erklæringen, der to grupper vil bli inkludert og alle forsøkspersoner vil gi sitt skriftlige samtykke til å bli arkivert.

Gruppe 1 kontrollgruppen: Totalt 50 friske frivillige som er aldersvarende friske kvinnelige frivillige som ikke lider av noen sykdom eller tar noen medisiner.

Gruppe 2 (malign brystsvulst): 50 kvinner med ikke-metastatisk primær brystkreft Pasienter som nylig er diagnostisert og som ennå ikke har fått cellegift eller strålebehandling, går til National Cancer Institute, New Cairo.

Full historikk vil bli tatt for alle saker og kontroll. Karakteristikkene til brystkreftpasientene med hensyn til alder, menopausal status, histopatologisk type, tumorstørrelse, lymfeknutemetastase og tumorgrad, samt østrogenreseptor (ER) og progesteronreseptor (PR) vil bli samlet inn for dataanalyse.

Eksklusjonskriterier

Pasienter med:

• Blodsykdomssykdommer, -Enhver annen kreft enn brystkreft
• Levercirrhose, livmor- og urinblæresykdommer

Metoder:

Rutinearbeid:

Blodprøvetaking:

5 ml blod vil bli samlet inn i vanlige vakcutainerrør for serumklargjøring. Serumprøver vil bli lagret ved -80 ºC frem til biokjemisk vurdering ved Biokjemiavdelingens forskningslaboratorium, Farmasøytisk fakultet, Ain Shams University.

Analyse av miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 ved kvantitativ PCR:

MiRNA og LncRNA vil bli ekstrahert fra serum ved hjelp av Qiagen miRNeasy Mini Kit i henhold til produsentens protokoll, og deres konsentrasjon og renhet vil bli oppdaget av nanodrop spektrofotometer.

Beriket RNA vil bli revers transkribert med miroRNA eller LncRNAs revers transkripsjonssett i henhold til produsentens protokoll.

Ekspresjon av miRNA og LncRNA vil bli kvantifisert ved qRT-PCR ved bruk av humane MicroRNA og LncRNA analysesett og deres spesifikke primere.

Ekspresjonsnivåene til det undersøkte miRNAet vil bli evaluert ved hjelp av ∆Ct-metoden [28]. Syklusterskelverdien (Ct) er antallet qPCR-sykluser som kreves for at det fluorescerende signalet skal krysse en spesifikk terskel. ∆Ct vil bli beregnet ved å subtrahere Ct-verdiene til RNU6-2 og GAPDH fra henholdsvis undersøkte miRNA-er og LncRNA-er. ∆∆Ct vil bli beregnet ved å trekke ∆Ct for kontrollprøvene fra ∆Ct for kreftprøvene.

Undersøkelse av hormonreseptorer og proteinbaserte tumormarkører: Både østrogenreseptor, progesteronreseptor og human epidermal vekstfaktorreseptor 2 (HER-2neu), i tillegg til CEA og CA15.3 tumormarkører ved bruk av ELISA-sett vil bli hentet fra National Cancer Institute , Nye Kairo.

ESTIMERING AV PRØVESTØRRELSE Målet med denne studien er å undersøke rollen til noen sirkulerende MiRNA-er fra uavhengige kontroll- og brystkrefttilfeller med 1 kontroll per forsøksperson. Basert på tidligere studie (Hu et al. 2012) var det onkogene små biomarkøruttrykket normalfordelt med standardavvik 2,9 og stor effektstørrelse (1,09). Hvis de sanne forskjellene i gjennomsnittet for brystkreftgruppen og kontrollgruppen er 2,25, må vi studere 25 forsøkspersoner og 25 kontrollpersoner for å kunne avvise nullhypotesen om at populasjonsmiddelverdiene for forsøks- og kontrollgruppene er like med sannsynlighet ( effekt) 0,8. Type I feilsannsynligheten knyttet til denne testen av denne nullhypotesen er 0,05.

Når det gjelder tumorsuppressor var ekspresjonsmiddel normalfordelt med stor effektstørrelse (1,4). Hvis de sanne forskjellene i gjennomsnittet for brystkreftgruppen og kontrollgruppen er 14, må vi studere 15 forsøkspersoner og 15 kontrollpersoner for å kunne avvise nullhypotesen om at populasjonsmiddelverdiene for forsøks- og kontrollgruppene er like med sannsynlighet ( effekt) 0,8. Type I feilsannsynligheten knyttet til denne testen av denne nullhypotesen er 0,05.

Samlet utvalgsstørrelse vil være 80 tilfeller, dette tallet vil økes med 25 % for forventet tap, og totalt utvalg er 100 personer, 50 personer per gruppe.

Prøvestørrelsesberegning ble utført av G power* prøvestørrelseskalkulator.

Statistisk analyse:

SPSS 21.0 programvarepakke (SPSS, Chicago, IL) vil bli brukt til å utføre de statistiske analysene. T-test eller Mann-Whitneys U-test vil bli brukt for å sammenligne forskjellen mellom kontinuerlige variabler i to grupper etter behov. Pearsons Chi-square-analyse eller Fishers eksakte test vil bli brukt for å sammenligne forskjellen mellom kategoriske variabler. Mottakeroperasjonskarakteristikk (ROC)-kurve og areal under ROC-kurven (AUC) vil bli plottet for å bestemme det beste grensepunktet som skiller mellom kreft- og ikke-kreftgrupper; sensitivitetene og spesifisitetene vil bli beregnet for miRNAene og deres diagnostiske effektivitet. For alle analyser vil en to-halet P-verdi på 0,05 eller mindre anses som statistisk signifikant.

5. Forskningstidsplan/ramme i. Tidsplan Q/år Handlinger Q1 Utarbeidelse av de offisielle dokumentene for prøveinnsamling, datainnsamling og etisk godkjenning og beregne prøvestørrelse for kontroll og pasienter Q2 Prøvetaking fra pasienter med utvalgte kriterier og separering av serum i alikvoter Q3 Fortsette prøvesamlinger og separering av serum i alikvoter + Ekstraksjon av RNA fra prøvene Q4 Innsamling av kontrollprøver og Ekstraksjon av RNA Q1 cDNA syntese for alle prøver + qPCR Q2 Statistisk analyse av dataene og begynnelse av oppgaveskriving + samling av relaterte artikler for oppgaveskriving Q3 Publikasjon av oppgaven og ferdigstillelse av oppgaven for revisjon

ii. Artikkeltittel: "Den diagnostiske nytten av tumorsuppressor eller onkogene små biomarkører i forbindelse med LncRNA i brystkreft"

Forfattere:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Tilsvarende innsendende forfatter: Prof. Nadia M. Hamdy Førsteforfatter: Marwa M. Mohamed Bidragende forfatter(e): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Referanseliste:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall og J. Reen, "Brystkreftdeteksjon ved bruk av dype konvolusjonelle nevrale nettverk og støttevektormaskiner," PeerJ, vol. 7, s. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr og J. A. Margenthaler," Molekylær profilering av brystkreft, "Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 23, nei. 3. S. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar," Behandling av metastatisk brystkreft, "i JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, vol. 12, nei. 5 SUPPL., s. 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith og D. C. Tomlinson, "Multidrug-resistant breast cancer: Current perspectives", "Breast Cancer: Targets and Therapy, vol. 6, nei. 0. pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal et al., "Landskap av somatiske mutasjoner i 560 helgenomsekvenser for brystkreft", "Nature, vol. 534, nr. 7605, s. 47-54, 2016.
6. M. T. Maurano et al., "Systematisk lokalisering av vanlig sykdomsassosiert variasjon i regulatorisk DNA," Science (80-.), vol. 337, nr. 6099, s. 1190-1195, 2012.
7. M. V. Iorio og C. M. Croce, "MicroRNA-dysregulering i kreft: Diagnostikk, overvåking og terapi. En omfattende anmeldelse, "EMBO Molecular Medicine, vol. 4, nei. 3. S. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi og D. P. Bartel, "The impact of microRNAs on protein output," Nature, vol. 7209, s. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim et al., "Microarray-analyse viser at noen mikroRNA-er nedregulerer et stort antall mål-mRNA-er," Nature, vol. 433, nr. 7027, s. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya og N. Sonenberg, "Mekanismer for post-transkripsjonell regulering av mikroRNA: Er svarene i sikte?" Nature Reviews Genetics, vol. 9, nei. 2. S. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller og H. A. Coller,"Et søk etter konserverte sekvenser i kodende regioner avslører at let-7 mikroRNA retter seg mot Dicer innenfor sin kodende sekvens, "Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 105, nei. 39, s. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong og J. A. Steitz, "Skifte fra undertrykkelse til aktivering: MicroRNAs kan oppregulere oversettelse", "Science (80-.), vol. 318, nr. 5858, s. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek og A. T. Remaley, "MikroRNA transporteres i plasma og leveres til mottakerceller av lipoproteiner med høy tetthet," Nat. Cell Biol., vol. 13, nei. 4, s. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee og J. O. Lotvall, "Eksosom-mediert overføring av mRNA og mikroRNA er en ny mekanisme for genetisk utveksling mellom celler.", "Nat. Cell Biol., vol. 9, nei. 6, s. 654-9, 2007.
15. J.L. Lindenberg et al., "Funksjonell levering av virale miRNAer via eksosomer", Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 107, nr. 14, s. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz og B. Burwinkel, "Ekstracellulære miRNA: Mysteriet om deres opprinnelse og funksjon," Trender Biochem. Sci., vol. 37, nei. 11, s. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin og F. J. Slack, "Et sannhetsserum for kreft ---- mikroRNA har stort potensial som kreftbiomarkører," Cell Res., vol. 18, nei. 10, s. 983-984, 2008.
18. Lu et al, "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research" (2018)
19. Cui, L. et al. Uttrykk av MicroRNA-301a og dets funksjonelle roller i malignt melanom. Cellulær fysiologi og biokjemi: internasjonalt tidsskrift for eksperimentell cellulær fysiologi, biokjemi og farmakologi 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. Økt ekspresjon av mikroRNA-301a i ikke-småcellet lungekreft og dens kliniske betydning. Journal of cancer research and therapeutics 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et al. miR-301a fremmer proliferasjon av kreftceller i bukspyttkjertelen ved direkte å hemme Bim-ekspresjon. Journal of cellular biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et al. Modulering av tumorigenese av det pro-inflammatoriske mikroRNA miR-301a i musemodeller av lungekreft og kolorektal kreft. Cell discovery 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski og H. Y. Chang, "Long non-coding RNAs and human disease," Trends in Cell Biology, vol. 21, nr.6. s. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov og I. Berindan-Neagoe, "Targeting ncRNAs by plant secondary metabolites: The ncRNAs game in balance to malignancy inhibition, "Biotechnology advances, vol. 36, nei. 6. S. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo og R. Johnson, "The long non-coding rnas: A new (p)layer in the dark matter," Frontiers in Genetics, vol. 2, nei. januar 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 samhandler med miR-765 og modulerer progresjon av plateepitelkarsinom i tungen ved å målrette LAMC2. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 fungerer som et konkurrerende endogent RNA for å regulere VEGFA-ekspresjon gjennom sponging av hsa-miR-29b-3p i duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim et al., "Korrelasjon av ultralydfinner med histologi, tumorgrad og biologiske markører ved brystkreft," ActaOncol. (Madar)., vol. 47, nei. 8, s. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig og G. Campbell, "Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine, "Clinical Chemistry, vol. 39, nei. 4. S. 561-577, 1993.

(30)Hu, Z.B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) Serum mikroRNA profilering og bryst kreftrisiko: bruk av miR-484/191 som endogene kontroller. Carcinogenesis, 33, 828-834.