Asse LINC00511/miR-185-3p e marcatori miR-301a-3p per la diagnosi del cancro al seno

1. Introduzione 1.1. Contesto: il cancro al seno è una delle principali cause di morte per le donne a livello globale, secondo l'Organizzazione mondiale della sanità (OMS), il numero di casi di cancro previsti nel 2025 sarà di 19,3 milioni di casi. In Egitto, il cancro è un problema crescente e in particolare il cancro al seno [1].

   Il cancro al seno è il tumore maligno femminile più comune e una grave minaccia per la salute delle donne e il suo sviluppo è caratterizzato da un’invasione locale considerevolmente aggressiva, da metastasi precoci e da resistenza multifarmaco alla chemioterapia [2, 3]. Pertanto, gli sviluppi di marcatori minimamente invasivi per la diagnosi precoce del cancro al seno sono di grande interesse.

   L’Atlante del genoma del cancro (TCGA) ha rivelato che molte delle mutazioni e dei cambiamenti del numero di copie riscontrati nel cancro non si sovrappongono ai geni codificanti proteine ​​[4], ma sono spesso localizzati nel DNA non codificante, inclusi i geni dell’RNA non codificante [5] . I microRNA (miRNA) sono stati tra i primi RNA non codificanti ad essere studiati contro il cancro e il loro ruolo come bersagli terapeutici o biomarcatori nel cancro [6].

   I MiRNA sono brevi sequenze di RNA a filamento singolo (di solito 19-23 nucleotidi) che controllano l’espressione genica in una varietà di processi fisiologici e di sviluppo, avendo quindi un ruolo critico nella regolazione posttrascrizionale dell’espressione genica in un’ampia gamma di sistemi biologici [7, 8]. I miRNA mediano la repressione dell'mRNA bersaglio mediante accoppiamento di basi con la sequenza complementare nel 3'-UTR, causando destabilizzazione del trascritto, repressione traslazionale o entrambe [9]. È stato riportato che i miRNA modulano anche l’espressione genica legandosi ad altre regioni, inclusi gli esoni codificanti proteine ​​[10], e possono persino indurre l’espressione genica nelle cellule di mammifero [11].

   I miRNA circolanti liberi di solito esistono legati a complessi ribonucleoproteici o lipoproteine ​​ad alta densità oppure vengono rilasciati dalle cellule in vescicole lipidiche, microvescicole, esosomi o corpi apoptotici [12-15]. Pertanto, i miRNA circolanti possono riflettere la risposta omeostatica del organismo, nonché segni di progressione della malattia. Grazie alla loro stabilità e resistenza all’attività della RNAsi endogena, questi miRNA sono stati proposti come biomarcatori diagnostici e prognostici per malattie, compreso il cancro [16].

   Tra questi miRNA, MiR-185-3p è stato identificato come un gene soppressore del tumore in vari tipi di cancro. L'espressione di miR-185-3p era diminuita nelle cellule di cancro al seno MDA-MB-231 e MCF-7. Inoltre, miR-185-3p era sovraespresso nella trasfezione silenziata con LINC00511, mentre diminuiva nella trasfezione del plasmide LINC00511 potenziato [17].

   MicroRNA-301a è un altro oncomiR che è stato correlato alla progressione del tumore in diversi tipi di cancro. Ad esempio, nel cancro alla prostata, nel cancro gastrico e nel cancro del pancreas [18-21]. Tuttavia, il suo ruolo nel cancro al seno non è stato completamente studiato.

   Gli RNA lunghi non codificanti (LncRNA) sono quelli più lunghi di 200 nucleotidi e molti di essi possono anche fungere da trascritti primari per produrre RNA corti. In generale, gli LncRNA sono stati implicati in ruoli di regolazione genetica, come la compensazione del dosaggio della cromatina, l’imprinting, la regolazione epigenetica, il controllo del ciclo cellulare, il traffico nucleare e citoplasmatico e la differenziazione cellulare [22]. Inoltre, l'interazione pre-mRNA in cui la trascrizione primaria interagisce con gli LncRNA e termina con una diversa sequenza di splicing funzionale o viene degradata in piccoli RNA interferenti endogeni, spugne di miRNA, modulazione dell'attività proteica o localizzazione e facilitazione della formazione del complesso riboproteico. Non da ultimo, gli LncRNA possono fungere da precursori per frammenti più piccoli come miRNA o piRNA. La funzione principale dei ciRNA consiste nella cattura dei miRNA attraverso interazioni complementari, funzionando come una spugna di miRNA [23]. Gli LncRNA sono già stati implicati nelle malattie umane, compreso il cancro [24].

   RNA intergenico lungo non codificante 00511 (LINC00511); è un oncogene che influenza le dimensioni del tumore, le metastasi e la prognosi sfavorevole. LINC00511 lega l'istone metiltransferasi EZH2 e specifica il modello di modifica dell'istone su p57 [25]. Agisce anche come oncogene nel carcinoma a cellule squamose e nell'adenocarcinoma duttale pancreatico [26]. In particolare, si sa poco se gli LncRNA possano fungere da biomarcatori per la prognosi o la diagnosi del cancro. [27] 1.2. Problema: il ruolo di questi biomarcatori non è stato ancora studiato nella diagnosi precoce del cancro al seno.

   1.3. Ipotesi: soppressore tumorale o biomarcatori oncogeni e LncRNA utilizzati nella diagnosi precoce del cancro al seno"

2. Scopo del lavoro:

   Lo scopo finale del lavoro è fornire un quadro più chiaro delle funzioni di miR-185-3p, miR-301a, in associazione con LINC00511 nella diagnosi precoce dei tumori al seno misurando sia la sensibilità che la specificità.

3. Risultati degli studi precedenti: a mezza pagina. Non sono stati condotti studi clinici precedenti sull'aspetto dell'utilità diagnostica dei biomarcatori studiati.

4. Dichiarazione problema:

   Il ruolo di questi biomarcatori non è stato ancora studiato nella diagnosi precoce del cancro al seno nelle pazienti egiziane.

5. Significato della ricerca:

Il risultato principale:

• Identificare il cancro al seno con soppressore tumorale circolante nel sangue periferico o piccoli biomarcatori oncogeni e confrontarlo con l'espressione di controllo normale

Risultato secondario:

• Calcolare la sensibilità e la specificità di miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 rispetto ai marcatori proteici (CEA e CA15-3) come marcatori diagnostici.

6. Obiettivi della ricerca:

1. Analizzare il livello di espressione di due miRNA (miR-185-3p, miR-301a) e il loro lncRNA interagito previsto (LINC00511) come marcatori molecolari minimi non invasivi per la diagnosi del cancro al seno primario.
2. Confrontare miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 con i marcatori basati su proteine ​​(CEA e CA15-3) come marcatori diagnostici, per quanto riguarda sensibilità e specificità.
3. Studiare la relazione tra miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 e i caratteri clinicopatologici del cancro al seno.
4. Metodologia di ricerca:

Questo studio sarà prima approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Farmacia, Università di Ain Shams e dal Comitato Etico del National Cancer Institute, New Cairo. Inoltre, sarà eseguito in aderenza alla Dichiarazione delle Linee Guida di Helsinki, dove saranno inclusi due gruppi e tutti i soggetti daranno il loro consenso scritto, per essere archiviati.

Gruppo 1, il gruppo di controllo: un totale di 50 volontari sani, volontarie sane della stessa età, che non soffrono di alcuna malattia o che assumono farmaci.

Gruppo 2 (tumore maligno al seno): 50 donne con cancro al seno primario non metastatico. Pazienti recentemente diagnosticati che non hanno ancora ricevuto alcuna chemioterapia o radioterapia, frequentanti il ​​National Cancer Institute, New Cairo.

Verrà raccolta la cronologia completa di tutti i casi e di tutti i controlli. Le caratteristiche delle pazienti con cancro al seno per quanto riguarda età, stato menopausale, tipo istopatologico, dimensione del tumore, metastasi linfonodali e grado del tumore, nonché recettore per gli estrogeni (ER) e recettore per il progesterone (PR) verranno raccolte per l'analisi dei dati.

Criteri di esclusione

Pazienti con:

• Malattie del sangue, -Qualsiasi cancro diverso dal cancro al seno
• Cirrosi epatica, malattie della vescica uterina e urinaria

Metodi:

Normale amministrazione:

Prelievo di sangue:

5 ml di sangue verranno raccolti in provette vaccitainer semplici per la preparazione del siero. I campioni di siero verranno conservati a -80 ºC fino alla valutazione biochimica presso il laboratorio di ricerca del Dipartimento di Biochimica, Facoltà di Farmacia, Università di Ain Shams.

Analisi di miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 mediante PCR quantitativa:

MiRNA e LncRNA saranno estratti dal siero utilizzando il kit Qiagen miRNeasy Mini secondo il protocollo del produttore e la loro concentrazione e purezza saranno rilevate mediante spettrofotometro a nanogocce.

L'RNA arricchito verrà trascritto inverso con il kit di trascrizione inversa miroRNA o LncRNA secondo il protocollo del produttore.

L'espressione di miRNA e LncRNA sarà quantificata mediante qRT-PCR utilizzando kit di analisi di MicroRNA e LncRNA umani e i loro primer specifici.

I livelli di espressione dei miRNA indagati saranno valutati utilizzando il metodo ∆Ct [28]. Il valore della soglia del ciclo (Ct) è il numero di cicli qPCR necessari affinché il segnale fluorescente superi una soglia specifica. Il ∆Ct sarà calcolato sottraendo i valori Ct di RNU6-2 e GAPDH da quelli dei miRNA e LncRNA indagati, rispettivamente. Il ∆∆Ct sarà calcolato sottraendo il ∆Ct dei campioni di controllo dal ∆Ct dei campioni tumorali.

Esame dei recettori ormonali e dei marcatori tumorali a base proteica: sia il recettore degli estrogeni, sia il recettore del progesterone che il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER-2neu), oltre ai marcatori tumorali CEA e CA15.3 utilizzando kit ELISA saranno ottenuti dal National Cancer Institute , Nuovo Cairo.

STIMA DELLA DIMENSIONE DEL CAMPIONE Lo scopo di questo studio è indagare il ruolo di alcuni MiRNA circolanti da controlli indipendenti e casi di cancro al seno con 1 controllo per soggetto sperimentale. Sulla base dello studio precedente (Hu et al. 2012) l'espressione dei piccoli biomarcatori oncogeni era normalmente distribuita con deviazione standard 2,9 e dimensione dell'effetto grande (1,09). Se le vere differenze tra le medie del gruppo con cancro al seno e del gruppo di controllo sono 2,25, dovremo studiare 25 soggetti sperimentali e 25 soggetti di controllo per poter rifiutare l'ipotesi nulla che le medie della popolazione dei gruppi sperimentale e di controllo siano uguali con probabilità ( potenza) 0,8. La probabilità di errore di tipo I associata a questo test di questa ipotesi nulla è 0,05.

Per quanto riguarda i mezzi di espressione del soppressore tumorale, i mezzi di espressione erano normalmente distribuiti con un'ampia dimensione dell'effetto (1,4). Se le vere differenze tra le medie del gruppo con cancro al seno e del gruppo di controllo sono 14, dovremo studiare 15 soggetti sperimentali e 15 soggetti di controllo per poter rifiutare l'ipotesi nulla che le medie della popolazione dei gruppi sperimentali e di controllo siano uguali con probabilità ( potenza) 0,8. La probabilità di errore di tipo I associata a questo test di questa ipotesi nulla è 0,05.

La dimensione totale del campione sarà di 80 casi, questo numero sarà aumentato del 25% per le perdite attese e il campione totale sarà di 100 soggetti, 50 soggetti per gruppo.

La stima della dimensione del campione è stata eseguita mediante il calcolatore della dimensione del campione G power*.

Analisi statistica:

Per eseguire le analisi statistiche verrà utilizzato il pacchetto software SPSS 21.0 (SPSS,Chicago,IL). Il test T o il test U di Mann-Whitney verranno utilizzati per confrontare la differenza delle variabili continue in due gruppi, a seconda dei casi. Per confrontare la differenza delle variabili categoriali verrà utilizzata l'analisi Chi-quadrato di Pearson o il test esatto di Fisher. Verranno tracciate la curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) e l'area sotto la curva ROC (AUC) per determinare il miglior punto di interruzione che discrimina tra gruppi cancerosi e non tumorali; la sensibilità e la specificità saranno calcolate per i miRNA e la loro efficacia diagnostica. Per tutte le analisi, un valore P a due code pari o inferiore a 0,05 sarà considerato statisticamente significativo.

5. Piano temporale/quadro della ricerca i. Piano temporale Q/anno Azioni Q1 Preparazione dei documenti ufficiali per la raccolta dei campioni, la raccolta dei dati e l'approvazione etica e calcolo delle dimensioni del campione per controlli e pazienti Q2 Raccolta dei campioni dai pazienti con criteri selezionati e separazione del siero in aliquote Q3 Continuare la raccolta dei campioni e la separazione dei siero in aliquote + Estrazione dell'RNA dai campioni Q4 Raccolta dei campioni di controllo ed estrazione dell'RNA Q1 Sintesi del cDNA per tutti i campioni + qPCR Q2 Analisi statistica dei dati e inizio della stesura di un articolo + raccolta di articoli correlati per la stesura della tesi Q3 Pubblicazione del l'elaborato e la finalizzazione della tesi per la revisione

ii. Titolo dell'articolo: "L'utilità diagnostica dei soppressori tumorali o dei piccoli biomarcatori oncogeni in associazione con LncRNA nel cancro al seno"

Autori:

Marwa M. Mohamed, Dott.ssa Eman Fouad Sanad, Dott.ssa Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Autore corrispondente presentatore: Prof. Nadia M. Hamdy Primo autore: Marwa M. Mohamed Autore collaboratore: Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

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