Ось LINC00511/miR-185-3p и маркеры miR-301a-3p для диагностики рака молочной железы

1. Введение 1.1. Справочная информация: Рак молочной железы является одной из ведущих причин смертности женщин во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), число случаев рака, ожидаемое в 2025 году, составит 19,3 миллиона случаев. В Египте растущей проблемой является рак, особенно рак молочной железы [1].

   Рак молочной железы является наиболее распространенной злокачественной опухолью у женщин и представляет серьезную угрозу здоровью женщин, а его развитие характеризуется значительной агрессивной местной инвазией, ранними метастазами и множественной лекарственной устойчивостью к химиотерапии [2, 3]. Поэтому большой интерес представляют разработки малоинвазивных маркеров для раннего выявления рака молочной железы.

   Атлас генома рака (TCGA) показал, что многие мутации и изменения числа копий, обнаруженные при раке, не перекрываются с генами, кодирующими белки [4], но часто локализуются в некодирующих генах ДНК, включая некодирующие РНК [5]. . МикроРНК (миРНК) были одними из первых некодирующих РНК, которые исследовали рак, а также их роль в качестве терапевтических мишеней или биомаркеров при раке [6].

   МикроРНК представляют собой короткие одноцепочечные последовательности РНК (обычно 19-23 нуклеотида), которые контролируют экспрессию генов в различных физиологических процессах и процессах развития, тем самым играя решающую роль в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов в широком диапазоне биологических систем [7, 8]. МикроРНК опосредуют репрессию мРНК-мишени путем спаривания оснований с комплементарной последовательностью в 3'-UTR, вызывая дестабилизацию транскрипта, репрессию трансляции или и то, и другое [9]. Сообщалось, что микроРНК также модулируют экспрессию генов путем связывания с другими областями, включая экзоны, кодирующие белки [10], и могут даже индуцировать экспрессию генов в клетках млекопитающих [11].

   Бесклеточные циркулирующие микроРНК обычно существуют в связи с рибонуклеопротеиновыми комплексами или липопротеинами высокой плотности или высвобождаются из клеток в липидных везикулах, микровезикулах, экзосомах или апоптотических тельцах [12-15]. Таким образом, циркулирующие микроРНК могут отражать гомеостатический ответ организма, а также признаки прогрессирования заболевания. Благодаря своей стабильности и устойчивости к активности эндогенной РНКазы эти микроРНК были предложены в качестве диагностических и прогностических биомаркеров заболеваний, включая рак [16].

   Среди этих микроРНК МиР-185-3p был идентифицирован как ген-супрессор опухоли при различных типах рака. Экспрессия миР-185-3p была снижена в клетках рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF-7. Более того, миР-185-3p сверхэкспрессировалась при молчащей трансфекции LINC00511 и снижалась при усиленной трансфекции плазмиды LINC00511 [17].

   МикроРНК-301a — еще одна онкомиР, связанная с прогрессированием опухоли при нескольких типах рака. Например, при раке простаты, раке желудка, а также раке поджелудочной железы [18-21]. Однако его роль при раке молочной железы до конца не изучена.

   Длинные некодирующие РНК (LncRNA) — это те, которые длиннее 200 нуклеотидов, и многие из них также могут действовать как первичные транскрипты для производства коротких РНК. Как правило, LncRNAs участвуют в регуляторных функциях генов, таких как компенсация дозы хроматина, импринтинг, эпигенетическая регуляция, контроль клеточного цикла, ядерный и цитоплазматический транспорт и дифференцировка клеток [22]. Кроме того, взаимодействие пре-мРНК, при котором первичный транскрипт взаимодействует с LncRNA и в конечном итоге получает другую функциональную сплайсированную последовательность или распадается на эндогенные малые интерферирующие РНК, губки микроРНК, модуляцию активности белка или локализацию и облегчение образования рибопротеинового комплекса. Не в последнюю очередь LncRNA могут служить предшественниками более мелких фрагментов, таких как miRNA или piRNA. Основная функция циРНК заключается в захвате миРНК посредством комплементарных взаимодействий, функционируя как губка миРНК [23]. LncRNAs уже вовлечены в развитие заболеваний человека, включая рак [24].

   Длинная межгенная некодирующая РНК 00511 (LINC00511); является онкогеном, который влияет на размер опухоли, метастазирование и плохой прогноз. LINC00511 связывает гистон-метилтрансферазу EZH2 и определяет паттерн модификации гистонов на p57 [25]. Он также действует как онкоген при плоскоклеточном раке и аденокарциноме протоков поджелудочной железы [26]. В частности, мало известно, могут ли LncRNA служить биомаркерами для прогноза или диагностики рака. [27] 1.2. Проблема: роль этих биомаркеров в ранней диагностике рака молочной железы еще не изучена.

   1.3. Гипотеза: опухолевые супрессоры или онкогенные биомаркеры и LncRNA используются для ранней диагностики рака молочной железы».

2. Цель работы:

   Конечная цель работы — предоставить более четкое представление о функциях миР-185-3p, миР-301a в сочетании с LINC00511 при ранней диагностике опухолей молочной железы с измерением как чувствительности, так и специфичности.

3. Результаты предыдущих исследований: на половине страницы. Никаких предыдущих клинических исследований по аспекту диагностической полезности изучаемых биомаркеров не проводилось.

4. Постановка задачи:

   Роль этих биомаркеров еще не изучена в ранней диагностике рака молочной железы у египетских пациентов.

5. Значение исследования:

Первичный результат:

• Определить циркулирующие в периферической крови опухолевые супрессоры или малые онкогенные биомаркеры рака молочной железы и сравнить их с нормальной контрольной экспрессией.

Вторичный результат:

• Рассчитать чувствительность и специфичность миР-185-3p, миР-301a и LINC00511 по сравнению с белковыми маркерами (CEA и CA15-3) в качестве диагностических маркеров.

6. Цели исследования:

1. Проанализируйте уровень экспрессии двух микроРНК (миР-185-3p, миР-301a) и их предсказанной взаимодействующей днРНК (LINC00511) в качестве минимальных неинвазивных молекулярных маркеров для диагностики первичного рака молочной железы.
2. Сравните миР-185-3p, миР-301a и LINC00511 с белковыми маркерами (CEA и CA15-3) в качестве диагностических маркеров с точки зрения чувствительности и специфичности.
3. Изучите связь между миР-185-3p, миР-301a и LINC00511 и клинико-патологическими особенностями рака молочной железы.
4. Методология исследования:

Это исследование сначала будет одобрено Этическим комитетом фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс и Этическим комитетом Национального института рака в Нью-Каире. Более того, оно будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией руководящих принципов, в которую будут включены две группы, и все субъекты дадут свое письменное согласие на архивирование.

Группа 1 - контрольная группа: всего 50 здоровых добровольцев, которые являются здоровыми женщинами-добровольцами соответствующего возраста, не страдающими какими-либо заболеваниями и не принимающими никаких лекарств.

Группа 2 (злокачественная опухоль молочной железы): 50 женщин с неметастатическим первичным раком молочной железы. Пациенты, у которых недавно диагностирован рак и еще не получали химиотерапию или лучевую терапию, посещают Национальный институт рака в Нью-Каире.

Будет собрана полная история всех случаев и контроля. Для анализа данных будут собраны характеристики больных раком молочной железы с учетом возраста, статуса менопаузы, гистопатологического типа, размера опухоли, метастазов в лимфатических узлах и степени опухоли, а также рецепторов эстрогена (ER) и рецепторов прогестерона (PR).

Критерий исключения

Пациенты с:

• Заболевания крови, -Любой рак, кроме рака молочной железы.
• Цирроз печени, заболевания матки и мочевого пузыря

Методы:

Однообразная раобта:

Забор крови:

5 мл крови будут собраны в простые пробирки-вакутайнеры для приготовления сыворотки. Образцы сыворотки будут храниться при температуре -80 ºC до биохимического анализа в исследовательской лаборатории кафедры биохимии фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс.

Анализ миР-185-3p, миР-301a и LINC00511 с помощью количественной ПЦР:

МикроРНК и LncRNA будут экстрагированы из сыворотки с использованием мини-набора Qiagen miRNeasy Mini Kit в соответствии с протоколом производителя, а их концентрация и чистота будут определены с помощью нанокапельного спектрофотометра.

Обогащенная РНК будет подвергаться обратной транскрипции с помощью набора для обратной транскрипции мироРНК или LncRNA в соответствии с протоколом производителя.

Экспрессию микроРНК и LncRNA будут количественно оценивать с помощью qRT-PCR с использованием наборов для анализа микроРНК и LncRNA человека и их специфических праймеров.

Уровни экспрессии исследуемых микроРНК будут оценивать с помощью метода ∆Ct [28]. Значение порога цикла (Ct) — это количество циклов qPCR, необходимых для того, чтобы флуоресцентный сигнал пересек определенный порог. ∆Ct будет рассчитываться путем вычитания значений Ct RNU6-2 и GAPDH из значений исследуемых микроРНК и LncRNA соответственно. ∆∆Ct будет рассчитываться путем вычитания ∆Ct контрольных образцов из ∆Ct образцов рака.

Исследование гормональных рецепторов и белковых опухолевых маркеров: рецептор эстрогена, рецептор прогестерона и рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER-2neu), в дополнение к опухолевым маркерам CEA и CA15.3, с использованием наборов ELISA будут получены из Национального института рака. , Новый Каир.

ОЦЕНКА РАЗМЕРА ВЫБОРКИ Целью данного исследования является изучение роли некоторых циркулирующих микроРНК в независимом контроле и случаях рака молочной железы с 1 контролем на каждого подопытного. Согласно предыдущему исследованию (Hu et al. 2012), экспрессия онкогенных малых биомаркеров нормально распределялась со стандартным отклонением 2,9 и большим размером эффекта (1,09). Если истинные различия между средними значениями группы рака молочной железы и контрольной группы составляют 2,25, нам нужно будет изучить 25 экспериментальных субъектов и 25 контрольных субъектов, чтобы иметь возможность отвергнуть нулевую гипотезу о том, что популяционные средние экспериментальной и контрольной групп равны по вероятности ( мощность) 0,8. Вероятность ошибки типа I, связанная с этой проверкой нулевой гипотезы, равна 0,05.

Что касается средств экспрессии опухолевого супрессора, они обычно распределялись с большой величиной эффекта (1,4). Если истинные различия в средних значениях группы рака молочной железы и контрольной группы равны 14, нам нужно будет изучить 15 экспериментальных субъектов и 15 контрольных субъектов, чтобы иметь возможность отвергнуть нулевую гипотезу о том, что популяционные средние экспериментальной и контрольной групп равны по вероятности ( мощность) 0,8. Вероятность ошибки типа I, связанная с этой проверкой нулевой гипотезы, равна 0,05.

Общий размер выборки составит 80 случаев, это число будет увеличено на 25% в случае ожидаемых потерь, а общая выборка составит 100 субъектов, по 50 субъектов на группу.

Оценка размера выборки осуществлялась с помощью калькулятора размера выборки G power*.

Статистический анализ:

Пакет программного обеспечения SPSS 21.0 (SPSS,Чикаго,Иллинойс) будет использоваться для проведения статистического анализа. T-тест или U-критерий Манна-Уитни будут использоваться для сравнения разницы непрерывных переменных в двух группах в зависимости от ситуации. Для сравнения различий категориальных переменных будет использоваться анализ хи-квадрат Пирсона или точный критерий Фишера. Кривая рабочей характеристики приемника (ROC) и площадь под кривой ROC (AUC) будут построены для определения наилучшей точки отсечения, позволяющей различать раковые и нераковые группы; чувствительность и специфичность будут рассчитаны для микроРНК и их диагностической эффективности. Для всех анализов двустороннее значение P, равное 0,05 или меньше, будет считаться статистически значимым.

5. Временной план/рамки исследования i. План времени Q/год Действия Q1 Подготовка официальных документов для сбора проб, сбора данных и этического одобрения, а также расчет размера выборки для контрольной группы и пациентов Q2 Сбор проб от пациентов с выбранными критериями и разделение сыворотки на аликвоты Q3 Продолжить сбор проб и разделение сыворотка в аликвотах + Экстракция РНК из образцов Q4 Сбор контрольных образцов и экстракция РНК Q1 Синтез кДНК для всех образцов + qPCR Q2 Статистический анализ данных и начало написания статьи + Сбор соответствующих статей для написания диссертации Q3 Публикация работа и доработка диссертации на доработку

ii. Название статьи: «Диагностическая ценность опухолевых супрессоров или малых онкогенных биомаркеров в сочетании с LncRNA при раке молочной железы»

Авторы:

Марва М. Мохамед, доктор Эман Фуад Санад, доктор Рехам Али Аббас Эль-Шими, Надя М. Хамди.

Соответствующий автор: профессор Надя М. Хамди Первый автор: Марва М. Мохамед Содействующий автор(ы): д-р Эман Фуад Санад, д-р Рехам Али Аббас Эль-Шими

6. Список литературы:

1. Д. А. Рагаб, М. Шаркас, С. Маршалл и Дж. Рин, «Обнаружение рака молочной железы с использованием глубоких сверточных нейронных сетей и машин опорных векторов», PeerJ, vol. 7, с. е6201, 2019.
2. AE Cyr и JA Margenthaler, «Молекулярное профилирование рака молочной железы», «Клиники хирургической онкологии Северной Америки», том. 23, нет. 3. Стр. 451-462, 2014.
3. У. Дж. Градишар, «Лечение метастатического рака молочной железы», в журнале JNCCN Национальной комплексной онкологической сети, 2014 г., том. 12, нет. 5 ПРИЛОЖЕНИЕ, стр. 759–761.
4. Х. Л. Мартин, Л. Смит и Д. К. Томлинсон, «Рак молочной железы с множественной лекарственной устойчивостью: современные перспективы», «Рак молочной железы: цели и терапия», том. 6, нет. 0. Стр. 1–13, 2014.
5. С. Ник-Зайнал и др., «Ландшафт соматических мутаций в 560 полногеномных последовательностях рака молочной железы», Nature, vol. 534, нет. 7605, стр. 47-54, 2016.
6. MT Maurano et al., «Систематическая локализация распространенных, связанных с заболеванием изменений в регуляторной ДНК», Science (80-.), vol. 337, нет. 6099, с. 1190-1195, 2012.
7. М. В. Иорио и К. М. Кроче, «Нарушение регуляции микроРНК при раке: диагностика, мониторинг и терапия». Подробный обзор «EMBO Molecular Medicine», vol. 4, нет. 3. Стр. 143-159, 2012.
8. Д. Бэк, Дж. Виллен, К. Шин, Ф. Д. Камарго, С. П. Гиги и Д. П. Бартель, «Влияние микроРНК на выход белка», Nature, vol. 7209, с. 64-71, 2008.
9. LP Lim et al., «Анализ микрочипов показывает, что некоторые микроРНК подавляют большое количество целевых мРНК», Nature, vol. 433, нет. 7027, с. 769-773, 2005.
10. В. Филипович, С. Н. Бхаттачарья и Н. Соненберг, «Механизмы посттранскрипционной регуляции с помощью микроРНК: ответы видны?» Nature Reviews Genetics, vol. 9, нет. 2. Стр. 102-114, 2008.
11. Дж. Дж. Форман, А. Легессе-Миллер и Х. А. Коллер. «Поиск консервативных последовательностей в кодирующих областях показывает, что микроРНК let-7 нацелена на Dicer в ее кодирующей последовательности», Proc. Натл. акад. наук, том. 105, нет. 39, с. 14879-14884, 2008.
12. С. Васудеван, Ю. Тонг и Дж. А. Стейтц, «Переключение от репрессии к активации: микроРНК могут активировать трансляцию», Science (80-.), vol. 318, нет. 5858, с. 1931-1934, 2007.
13. K.C. Vickers, BT Palmisano, BM Shoucri, RD Shamburek и AT Remaley, «МикроРНК транспортируются в плазме и доставляются в клетки-реципиенты с помощью липопротеинов с высокой плотностью», Nat. Клеточная Биол., вып. 13, нет. 4, с. 423-435, 2011.
14. Х. Валади, К. Экстром, А. Боссиос, М. Сьостранд, Дж. Дж. Ли и Дж. О. Лотвалл, «Опосредованный экзосомами перенос мРНК и микроРНК - это новый механизм генатического обмена между клетками». «Nat. Клеточная Биол., вып. 9, нет. 6, с. 654-9, 2007.
15. JL Lindenberg и др., «Функциональная доставка вирусных микроРНК через экзосомы», Proc. Натл. акад. наук, том. 107, нет. 14, с. 6328-6333, 2010.
16. А. Турчинович, Л. Вейц и Б. Бурвинкель, «Внеклеточные микроРНК: тайна их происхождения и функции», Trends Biochem. наук, том. 37, нет. 11, с. 460-465, 2012.
17. Л. Дж. Чин и Ф. Дж. Слэк, «Сыворотка правды от рака. МикроРНК обладают большим потенциалом в качестве биомаркеров рака», Cell Res., vol. 18, нет. 10, с. 983-984, 2008.
18. Лу и др., «Журнал экспериментальных и клинических исследований рака» (2018 г.)
19. Кюи, Л. и др. Экспрессия микроРНК-301a и ее функциональная роль при злокачественной меланоме. Клеточная физиология и биохимия: международный журнал экспериментальной клеточной физиологии, биохимии и фармакологии 40, 230–244 (2016).
20. Ши, Ю.К., Занг, К.Л., Ли, Г.К., Хуанг, Ю. и Ван, С.З. Повышенная экспрессия микроРНК-301a при немелкоклеточном раке легких и ее клиническое значение. Журнал исследований и терапии рака 12, 693–698 (2016).
21. Чен, З. и др. миР-301a способствует пролиферации клеток рака поджелудочной железы путем прямого ингибирования экспрессии Bim. Журнал клеточной биохимии 113, 3229-3235, (2012).
22. Ма, X. и др. Модуляция онкогенеза с помощью провоспалительной микроРНК миР-301a на мышиных моделях рака легких и колоректального рака. Открытие клеток 1, 15005, (2015).
23. О. Вапински и Х. Ю. Чанг, «Длинные некодирующие РНК и болезни человека», Тенденции в клеточной биологии, том. 21, №6. стр. 354-361, 2011.
24. Д. Гулей, Н. Мехтеров, С. М. Набави, А. Г. Атанасов и И. Бериндан-Неаго, «Нацеливание на нкРНК с помощью вторичных метаболитов растений: игра нкРНК в балансе в направлении ингибирования злокачественных опухолей», «Достижения биотехнологии», том. 36, нет. 6. Стр. 1779-1799, 2018.
25. Т. Дерриен, Р. Гиго и Р. Джонсон, «Длинные некодирующие РНК: новый (p) слой в «темной материи», Frontiers in Genetics, vol. 2, нет. Январь 2012 г.
26. Дин Дж., Ян С., Ян С. LINC00511 взаимодействует с миР-765 и модулирует прогрессирование плоскоклеточного рака языка путем нацеливания на LAMC2. J Оральный Патол Мед. 2018;47:46876.
27. Чжао X, Лю Y, Ли Z, Чжэн S, Ван Z, Li W, Bi Z, Ли L, Цзян Y, Луо Y, Линь Q, Фу Z, Руфу C. Linc00511 действует как конкурирующая эндогенная РНК, регулируя экспрессию VEGFA. путем проникновения hsa-миР-29b-3p при аденокарциноме протоков поджелудочной железы. J Cell Мол Мед. 2018;22:655-67
28. SH Kim и др., «Корреляция ультразвуковых результатов с гистологией, степенью опухоли и биологическими маркерами при раке молочной железы», ActaOncol. (Мадар)., т. 47, нет. 8, с. 1531-1538, 2008.
29. М. Х. Цвейг и Г. Кэмпбелл, «Графики рабочих характеристик приемника (ROC): фундаментальный инструмент оценки в клинической медицине», «Клиническая химия», том. 39, нет. 4. Стр. 561-577, 1993.

(30) Ху, З. Б., Дж. Донг, Л. Э. Ван, Х. Х. Ма, Дж. Б. Лю, Ю. Чжао, Дж. Х. Тан, X. Чен, Дж. К. Дай, QY Вэй, CY Чжан и Х. Б. Шен (2012) Профилирование микроРНК сыворотки и грудь риск рака: использование миР-484/191 в качестве эндогенного контроля. Канцерогенез, 33, 828-834.