用于乳腺癌诊断的 LINC00511/miR-185-3p 轴和 miR-301a-3p 标记物

1. 简介 1.1。 背景：乳腺癌是全球女性死亡的主要原因之一，根据世界卫生组织（WHO）的数据，预计2025年癌症病例数将达到1930万例。 在埃及，癌症尤其是乳腺癌是一个日益严重的问题[1]。

   乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发展具有相当严重的局部侵袭性、早期转移和对化疗的多药耐药性，对女性健康构成重大威胁[2, 3]。 因此，开发用于早期检测乳腺癌的微创标记物引起了人们的极大兴趣。

   癌症基因组图谱 (TCGA) 显示，癌症中发现的许多突变和拷贝数变化并不与蛋白质编码基因重叠 [4]，而是经常位于非编码 DNA（包括非编码 RNA）基因中 [5] 。 MicroRNA (miRNA) 是最早研究癌症的非编码 RNA 之一，及其作为癌症治疗靶点或生物标志物的作用 [6]。

   miRNA 是短的单链 RNA 序列（通常为 19-23 个核苷酸），可在多种生理和发育过程中控制基因表达，因此在广泛的生物系统中基因表达的转录后调控中具有关键作用 [7， 8]。 miRNA 通过与 3'-UTR 中的互补序列碱基配对来介导靶 mRNA 的抑制，导致转录物不稳定、翻译抑制或两者兼有 [9]。 据报道，miRNA 还通过与其他区域（包括蛋白质编码外显子）结合来调节基因表达 [10]，甚至可以诱导哺乳动物细胞中的基因表达 [11]。

   无细胞循环 miRNA 通常与核糖核蛋白复合物或高密度脂蛋白结合存在，或者它们从细胞中的脂囊泡、微泡、外泌体或凋亡小体中释放[12-15]。因此，循环 miRNA 可能反映细胞的稳态反应。有机体，以及疾病进展的迹象。 由于其稳定性和对内源性 RNAse 活性的抵抗力，这些 miRNA 已被提议作为疾病（​​包括癌症）的诊断和预后生物标志物 [16]。

   在这些 miRNA 中，MiR-185-3p 已被确定为多种癌症的抑癌基因。 乳腺癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 中 miR-185-3p 的表达降低。 此外，miR-185-3p在LINC00511沉默转染中过度表达，而在增强LINC00511质粒转染中降低[17]。

   MicroRNA-301a 是另一种 oncomiR，与多种癌症的肿瘤进展相关。 例如，在前列腺癌、胃癌以及胰腺癌中[18-21]。 然而，其在乳腺癌中的作用尚未得到充分研究。

   长非编码RNA（LncRNA）是指长度超过200个核苷酸的RNA，其中许多也可以作为初级转录物产生短RNA。 一般来说，LncRNA 与基因调节作用有关，例如染色质剂量补偿、印记、表观遗传调节、细胞周期控制、核和细胞质运输以及细胞分化 [22]。 此外，初级转录物与 LncRNA 相互作用并最终产生不同的功能剪接序列或降解为内源性小干扰 RNA、miRNA 海绵的前 mRNA 相互作用，调节蛋白质活性或定位并促进核糖蛋白复合物形成。 更重要的是，LncRNA 可以作为 miRNA 或 piRNA 等较小片段的前体。 ciRNA 的主要功能在于通过互补相互作用捕获 miRNA，其功能类似于 miRNA 海绵 [23]。 LncRNA 已经与包括癌症在内的人类疾病有关[24]。

   长基因间非编码RNA 00511 (LINC00511)；是一种癌基因，影响肿瘤大小、转移和不良预后。 LINC00511 结合组蛋白甲基转移酶 EZH2 并指定 p57 上的组蛋白修饰模式 [25]。 它还在鳞状细胞癌和胰腺导管腺癌中充当癌基因[26]。 特别是，人们对 LncRNA 是否可以作为癌症预后或诊断的生物标志物知之甚少。 [27]1.2。 问题：这些生物标志物在乳腺癌早期诊断中的作用尚未得到研究。

   1.3. 假设：抑癌或致癌生物标志物和LncRNA用于乳腺癌早期诊断"

2. 工作目的：

   这项工作的最终目的是通过测量敏感性和特异性，更清楚地了解 miR-185-3p、miR-301a 与 LINC00511 在乳腺肿瘤早期诊断中的功能。

3. 先前的研究结果：半页。 之前没有对所研究的生物标志物的诊断效用方面进行临床研究。

4. 问题陈述：

   这些生物标志物在埃及患者乳腺癌早期诊断中的作用尚未得到研究。

5. 研究意义：

主要成果：

• 识别乳腺癌的外周血循环肿瘤抑制因子或致癌小生物标志物，并与正常对照表达进行比较

次要结果：

• 计算miR-185-3p、miR-301a 和LINC00511 与作为诊断标记的基于蛋白质的标记（CEA 和CA15-3）相比的敏感性和特异性。

六、研究目标：

1. 分析两种 miRNA（miR-185-3p、miR-301a）的表达水平及其预测的相互作用 lncRNA (LINC00511)，作为诊断原发性乳腺癌的最小非侵入性分子标记。
2. 将 miR-185-3p、miR-301a 和 LINC00511 与作为诊断标记物的蛋白质标记物（CEA 和 CA15-3）进行比较，了解敏感性和特异性。
3. 研究miR-185-3p、miR-301a、LINC00511与乳腺癌临床病理特征的关系。
4. 研究方法论：

这项研究将首先得到艾因夏姆斯大学药学院伦理委员会和新开罗国家癌症研究所伦理委员会的批准。 此外，它将按照《赫尔辛基指南宣言》进行，其中将包括两个小组，并且所有受试者都将书面同意并存档。

第1组对照组：健康志愿者共50名，均为年龄相匹配的健康女性志愿者，未患有任何疾病，未服用任何药物。

第 2 组（恶性乳腺肿瘤）：50 名患有非转移性原发性乳腺癌的女性，最近诊断出尚未接受任何化疗或放疗的患者，就诊于新开罗国家癌症研究所。

所有病例和对照都将记录完整的历史记录。 将收集乳腺癌患者的年龄、绝经状态、组织病理学类型、肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤分级以及雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）等特征进行数据分析。

排除标准

患者患有：

• 血液紊乱疾病，-除乳腺癌以外的任何癌症
• 肝硬化、子宫及膀胱疾病

方法：

日常工作：

血液采样：

将 5 ml 血液收集到普通真空采血管中用于血清制备。 血清样本将保存在 -80 ℃ 下，直至在艾因夏姆斯大学药学院生物化学系研究实验室进行生化评估。

通过定量 PCR 检测 miR-185-3p、miR-301a 和 LINC00511：

根据制造商的方案，使用Qiagen miRNeasy Mini Kit从血清中提取miRNA和LncRNA，并通过nanodrop分光光度计检测它们的浓度和纯度。

富集的 RNA 将根据制造商的方案使用 miroRNA 或 LncRNA 逆转录试剂盒进行逆转录。

miRNA 和 LncRNA 的表达将使用人类 MicroRNA 和 LncRNA 检测试剂盒及其特异性引物通过 qRT-PCR 进行定量。

所研究的 miRNA 的表达水平将使用 ΔCt 方法进行评估 [28]。 循环阈值 (Ct) 是荧光信号跨越特定阈值所需的 qPCR 循环数。 ΔCt 将通过分别从研究的 miRNA 和 LncRNA 的 Ct 值中减去 RNU6-2 和 GAPDH 的 Ct 值来计算。 ΔΔCt 将通过从癌症样本的 ΔCt 中减去对照样本的 ΔCt 来计算。

激素受体和蛋白质肿瘤标志物检查：雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体 2 (HER-2neu) 以及使用 ELISA 试剂盒的 CEA 和 CA15.3 肿瘤标志物均从国家癌症研究所获得，新开罗。

样本大小估计本研究的目的是研究来自独立对照和乳腺癌病例（每个实验对象有 1 个对照）的一些循环 miRNA 的作用。 根据之前的研究（Hu et al. 2012），致癌的小生物标志物表达呈正态分布，标准差为 2.9，效应量较大（1.09）。 如果乳腺癌组和对照组平均值的真实差异为 2.25，我们将需要研究 25 名实验对象和 25 名对照对象，以便能够拒绝实验组和对照组的总体平均值在概率上相等的零假设（功率）0.8。 与此原假设检验相关的 I 类错误概率为 0.05。

至于肿瘤抑制因子的表达均值呈正态分布，效应大小较大 (1.4)。 如果乳腺癌组和对照组平均值的真实差异为 14，我们将需要研究 15 名实验对象和 15 名对照对象，以便能够拒绝实验组和对照组的总体平均值在概率上相等的零假设（功率）0.8。 与此原假设检验相关的 I 类错误概率为 0.05。

总样本量为 80 例，由于预期损失，该数量将增加 25%，总样本为 100 名受试者，每组 50 名受试者。

样本量估计由 G power* 样本量计算器执行。

统计分析：

SPSS 21.0软件包（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州）将用于进行统计分析。 酌情使用T检验或Mann-Whitney's U检验来比较两组连续变量的差异。 将采用皮尔逊卡方分析或费舍尔精确检验来比较分类变量的差异。 将绘制受试者工作特征（ROC）曲线和ROC曲线下面积（AUC）以确定区分癌症和非癌症组的最佳分界点；将计算 miRNA 的敏感性和特异性及其诊断功效 对于所有分析，0.05 或更低的双尾 P 值将被视为具有统计显着性。

5. 研究时间计划/框架 时间计划 季度/年 行动 Q1 准备样本采集、数据采集和伦理批准的官方文件，并计算对照和患者的样本量 Q2 从符合选定标准的患者中采集样本，并等分分离血清 Q3 继续样本采集和分离血清等份血清 + 从样品中提取 RNA Q4 收集对照样品并提取 RNA Q1 所有样品的 cDNA 合成 + qPCR Q2 数据统计分析并开始撰写论文 + 收集用于论文写作的相关文章 Q3 发表论文论文并完成论文修改

二.论文标题：“乳腺癌中肿瘤抑制因子或致癌小生物标志物与 LncRNA 相关的诊断效用”

作者：

Marwa M. Mohamed、Eman Fouad Sanad 博士、Reham Ali Abbas El-Shimy 博士、Nadia M. Hamdy。

通讯作者：Nadia M. Hamdy 教授 第一作者：Marwa M. Mohamed 贡献作者(S)：Eman Fouad Sanad 博士、Reham Ali Abbas El-Shimy 博士

6. 参考文献列表：

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