LINC00511/miR-185-3p Axis ja miR-301a-3p Markkerit rintasyövän diagnosointiin

1. Johdanto 1.1. Taustaa: Rintasyöpä on yksi yleisimmistä naisten kuolinsyistä maailmanlaajuisesti, Maailman terveysjärjestön (WHO) mukaan vuonna 2025 syöpätapausten odotetaan olevan 19,3 miljoonaa. Egyptissä syöpä ja erityisesti rintasyöpä on kasvava ongelma [1].

   Rintasyöpä on yleisin naisten pahanlaatuinen kasvain ja suuri uhka naisten terveydelle, ja sen kehittyminen on huomattavan aggressiivinen paikallinen hyökkäys, varhaiset etäpesäkkeet ja monilääkeresistenssi kemoterapialle [2, 3]. Siksi minimaalisesti invasiivisten merkkiaineiden kehitys rintasyövän varhaiseen havaitsemiseen on erittäin kiinnostavaa.

   Syövän genomi Atlas (TCGA) paljasti, että monet syövissä havaituista mutaatioista ja kopiomäärän muutoksista eivät mene päällekkäin proteiinia koodaavien geenien kanssa [4], vaan ne sijaitsevat usein ei-koodaavissa DNA:ssa, mukaan lukien ei-koodaavat RNA-geenit [5]. . MikroRNA:t (miRNA:t) olivat ensimmäisiä ei-koodaavia RNA:ita, joita tutkittiin syöpää ja niiden roolia terapeuttisina kohteina tai biomarkkereina syövässä [6].

   MiRNA:t ovat lyhyitä, yksijuosteisia RNA-sekvenssejä (yleensä 19-23 nukleotidia), jotka säätelevät geenin ilmentymistä erilaisissa fysiologisissa ja kehitysprosesseissa, joten niillä on kriittinen rooli geeniekspression posttranskriptionaalisessa säätelyssä monissa biologisissa järjestelmissä [7, 8]. MiRNA:t välittävät kohde-mRNA:n repressiota muodostamalla emäspariutumisen komplementaariseen sekvenssiin 3'-UTR:ssa, mikä aiheuttaa transkriptin epävakautta, translaatiorepressiota tai molempia [9]. On raportoitu, että miRNA:t moduloivat myös geeniekspressiota sitoutumalla muihin alueisiin, mukaan lukien proteiinia koodaaviin eksoneihin [10], ja voivat jopa indusoida geenin ilmentymistä nisäkässoluissa [11].

   Soluttomia kiertäviä miRNA:ita esiintyy yleensä sitoutuneena ribonukleoproteiinikomplekseihin tai suuritiheyksisiin lipoproteiiniin tai ne vapautuvat soluista lipidivesikkeleissä, mikrovesikkeleissä, eksosomeissa tai apoptoottisissa kappaleissa [12-15]. Näin ollen kiertävät miRNA:t voivat heijastaa solujen homeostaattista vastetta. elimistöön sekä taudin etenemisen merkkejä. Näiden miRNA:iden stabiiliuden ja endogeenisen RNAaasi-aktiivisuuden vastustuskyvyn vuoksi niitä on ehdotettu diagnostisiksi ja prognostisiksi biomarkkereiksi sairauksille, mukaan lukien syöpä [16].

   Näistä miRNA:ista MiR-185-3p on tunnistettu kasvainsuppressorigeeniksi erityyppisissä syövissä. MiR-185-3p:n ilmentyminen väheni rintasyöpäsoluissa MDA-MB-231 ja MCF-7. Lisäksi miR-185-3p yli-ilmennettiin LINC00511-hiljennetyssä transfektiossa, kun taas se väheni tehostetussa LINC00511-plasmiditransfektiossa [17].

   MicroRNA-301a on toinen oncomiR, joka on liittynyt kasvaimen etenemiseen useissa syöpätyypeissä. Esimerkiksi eturauhassyövässä, mahasyövässä sekä haimasyövässä [18-21]. Sen roolia rintasyövässä ei kuitenkaan ole täysin tutkittu.

   Pitkät ei-koodaavat RNA:t (LncRNA:t) ovat niitä, jotka ovat pidempiä kuin 200 nukleotidia, ja monet niistä voivat myös toimia primäärisinä transkripteina tuottamaan lyhyitä RNA:ita. Yleensä LncRNA:t on liitetty geenien säätelyrooleihin, kuten kromatiiniannoksen kompensointiin, painamiseen, epigeneettiseen säätelyyn, solusyklin hallintaan, tuma- ja sytoplasmaliikenteeseen ja solujen erilaistumiseen [22]. Lisäksi pre-mRNA-vuorovaikutus, jossa primaarinen transkripti on vuorovaikutuksessa LncRNA:iden kanssa ja päätyy erilaiseen toiminnalliseen silmukoituneeseen sekvenssiin tai hajoaa endogeenisiksi pieniksi häiritseviksi RNA:iksi, miRNA-sieniksi, proteiiniaktiivisuuden modulaatio tai lokalisaatio ja riboproteiinikompleksin muodostumisen helpottaminen. Ei vähiten, LncRNA:t voivat toimia esiasteina pienemmille fragmenteille, kuten miRNA:ille tai piRNA:ille. CiRNA:iden päätehtävä on miRNA:iden vangitseminen komplementaaristen vuorovaikutusten kautta, jotka toimivat miRNA:iden sienen tavoin [23]. LncRNA:t on jo liitetty ihmisten sairauksiin, mukaan lukien syöpään [24].

   Pitkä intergeeninen ei-koodaava RNA 00511 (LINC00511); on onkogeeni, joka vaikuttaa kasvaimen kokoon, etäpesäkkeisiin ja huonoon ennusteeseen. LINC00511 sitoo histonimetyylitransferaasia EZH2:ta ja määrittää histonin modifikaatiokuvion p57:ssä [25]. Se toimii myös onkogeeninä okasolukarsinoomassa ja haiman duktaalisen adenokarsinoomassa [26]. Erityisesti tiedetään vähän, voivatko LncRNA:t toimia biomarkkereina syövän ennusteelle tai diagnoosille. [27] 1.2. Ongelma: Näiden biomarkkerien roolia rintasyövän varhaisessa diagnosoinnissa ei ole vielä tutkittu.

   1.3. Hypoteesi: Kasvainsuppressori tai onkogeeniset biomarkkerit ja LncRNA, joita käytetään rintasyövän varhaisessa diagnosoinnissa"

2. Työn tarkoitus:

   Työn perimmäisenä tavoitteena on antaa selkeämpi kuva miR-185-3p:n, miR-301a:n toiminnoista yhdessä LINC00511:n kanssa rintakasvainten varhaisessa diagnosoinnissa sekä herkkyyttä että spesifisyyttä mittaamalla.

3. Aiempien tutkimusten tulokset: puolessa sivussa. Tutkittujen biomarkkerien diagnostisista hyödyistä ei ole tehty aikaisempia kliinisiä tutkimuksia.

4. Ongelmailmoitus:

   Näiden biomarkkerien roolia ei ole vielä tutkittu rintasyövän varhaisessa diagnosoinnissa egyptiläisillä potilailla.

5. Tutkimusmerkitys:

Ensisijainen tulos:

• Tunnistaa perifeerisessä veressä kiertävä kasvainsuppressori tai onkogeeniset pienet biomarkkerit rintasyöpä ja verrata normaaliin kontrolliekspressioon

Toissijainen tulos:

• Laske miR-185-3p:n, miR-301a:n ja LINC00511:n herkkyys ja spesifisyys verrattuna proteiinipohjaisiin markkereihin (CEA ja CA15-3) diagnostisina markkereina.

6. Tutkimustavoitteet:

1. Analysoi kahden miRNA:n (miR-185-3p, miR-301a) ja niiden ennustetun vuorovaikutteisen lncRNA:n (LINC00511) ilmentymistaso minimaalisina ei-invasiivisina molekyylimarkkereina primaarisen rintasyövän diagnosoimiseksi.
2. Vertaa miR-185-3p, miR-301a ja LINC00511 proteiinipohjaisiin markkereihin (CEA ja CA15-3) diagnostisina markkereina herkkyyden ja spesifisyyden suhteen.
3. Tutki miR-185-3p:n, miR-301a:n ja LINC00511:n välistä suhdetta ja rintasyövän kliinisiä patologisia ominaisuuksia.
4. Tutkimusmenetelmät:

Tämän tutkimuksen hyväksyvät ensin Ain Shamsin yliopiston farmasian tiedekunnan eettinen komitea ja New Cairon kansallisen syöpäinstituutin eettinen komitea. Lisäksi se toteutetaan Helsingin suuntaviivojen julistuksen mukaisesti, jossa on mukana kaksi ryhmää ja kaikki aiheet antavat kirjallisen suostumuksensa arkistointiin.

Ryhmä 1 kontrolliryhmä: Yhteensä 50 tervettä vapaaehtoista, jotka ovat ikäisiä terveitä naispuolisia vapaaehtoisia, jotka eivät kärsi mistään sairaudesta tai käytä lääkkeitä.

Ryhmä 2 (pahanlaatuinen rintakasvain): 50 naista, joilla on ei-metastaattinen primaarinen rintasyöpä. Äskettäin diagnosoidut potilaat, jotka eivät ole vielä saaneet mitään kemoterapiaa tai sädehoitoa, osallistuvat National Cancer Institute, New Cairo.

Kaikista tapauksista ja valvonnasta otetaan koko historia. Aineiston analysointia varten kerätään rintasyöpäpotilaiden ominaisuudet iän, vaihdevuosien tilan, histopatologisen tyypin, kasvaimen koon, imusolmukkeiden etäpesäkkeiden ja kasvaimen asteen osalta sekä estrogeenireseptorin (ER) ja progesteronireseptorin (PR).

Poissulkemiskriteerit

Potilaat, joilla on:

• Verihäiriösairaudet - Mikä tahansa muu syöpä kuin rintasyöpä
• Maksakirroosi, kohdun ja virtsarakon sairaudet

Menetelmät:

Rutiinityö:

Verinäytteet:

5 ml verta kerätään tavallisiin vaccutainer-putkiin seerumin valmistusta varten. Seeruminäytteitä säilytetään -80 ºC:ssa biokemialliseen arviointiin asti Ain Shams -yliopiston farmasian tiedekunnan biokemian osaston tutkimuslaboratoriossa.

MiR-185-3p:n, miR-301a:n ja LINC00511:n määritys kvantitatiivisella PCR:llä:

MiRNA- ja LncRNA-solut uutetaan seerumista Qiagen miRNeasy Mini Kitillä valmistajan ohjeiden mukaisesti ja niiden pitoisuus ja puhtaus havaitaan nanodrop-spektrofotometrillä.

Rikastettu RNA käänteistranskriptoidaan miroRNA- tai LncRNAs-käänteistranskriptiosarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

MiRNA:n ja LncRNA:iden ilmentyminen kvantifioidaan qRT-PCR:llä käyttämällä ihmisen MicroRNA- ja LncRNAs-määrityspakkauksia ja niiden spesifisiä alukkeita.

Tutkitun miRNA:n ilmentymistasot arvioidaan ∆Ct-menetelmällä [28]. Jakson kynnysarvo (Ct) on qPCR-jaksojen lukumäärä, joka tarvitaan, jotta fluoresoiva signaali ylittää tietyn kynnyksen. ∆Ct lasketaan vähentämällä RNU6-2:n ja GAPDH:n Ct-arvot tutkittujen miRNA:iden ja LncRNA:iden arvoista, vastaavasti. ∆∆Ct lasketaan vähentämällä kontrollinäytteiden ∆Ct syöpänäytteiden ∆Ct:stä.

Hormonireseptorien ja proteiinipohjaisten kasvainmarkkerien tutkiminen: Sekä estrogeenireseptorin, progesteronireseptorin että ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin 2 (HER-2neu) lisäksi CEA- ja CA15.3-kasvainmarkkereiden lisäksi ELISA-pakkauksia saadaan National Cancer Institutelta. , Uusi Kairo.

OTEKOON ARVIOINTI Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia joidenkin riippumattomien kontrollien ja rintasyöpätapausten kiertävien MiRNA:iden roolia 1 kontrollilla koehenkilöä kohden. Aiemman tutkimuksen (Hu et al. 2012) perusteella onkogeenisten pienten biomarkkerien ilmentyminen jakautui normaalisti standardipoikkeamalla 2,9 ja suurella vaikutuskoolla (1,09). Jos todelliset erot rintasyöpäryhmän ja kontrolliryhmän keskiarvoissa on 2,25, meidän on tutkittava 25 koehenkilöä ja 25 kontrollihenkilöä voidaksemme hylätä nollahypoteesin, jonka mukaan koe- ja kontrolliryhmän populaatiokeskiarvot ovat yhtä suuret todennäköisyydellä ( teho) 0,8. Tämän nollahypoteesin testiin liittyvä tyypin I virhetodennäköisyys on 0,05.

Mitä tulee kasvainsuppressoreihin, ilmentymiskeskiarvot jakautuivat normaalisti suurella vaikutuskoolla (1,4). Jos todelliset erot rintasyöpäryhmän ja kontrolliryhmän keskiarvoissa on 14, meidän on tutkittava 15 koehenkilöä ja 15 kontrollihenkilöä voidaksemme hylätä nollahypoteesin, jonka mukaan koe- ja kontrolliryhmän populaatiokeskiarvot ovat yhtä suuret todennäköisyydellä ( teho) 0,8. Tämän nollahypoteesin testiin liittyvä tyypin I virhetodennäköisyys on 0,05.

Kokonaisotoskoko on 80 tapausta, tätä määrää lisätään 25 % odotettavissa olevien menetysten vuoksi, ja kokonaisotos on 100 henkilöä, 50 henkilöä ryhmää kohden.

Näytteen koon estimointi suoritettiin G power* -näytteen kokolaskurilla.

Tilastollinen analyysi:

Tilastollisten analyysien suorittamiseen käytetään SPSS 21.0 -ohjelmistopakettia (SPSS,Chicago,IL). T-testiä tai Mann-Whitneyn U-testiä käytetään kahden ryhmän jatkuvien muuttujien erojen vertailuun tarpeen mukaan. Kategoristen muuttujien erojen vertaamiseen käytetään Pearsonin Chi-neliöanalyysiä tai Fisherin tarkkaa testiä. Vastaanottimen toimintakäyrä (ROC) ja ROC-käyrän alla oleva pinta-ala (AUC) piirretään parhaan rajapisteen määrittämiseksi, joka erottaa syövän ja ei-syöpäryhmien välillä. herkkyydet ja spesifisyydet lasketaan miRNA:ille ja niiden diagnostiselle tehokkuudelle. Kaikissa analyyseissä kaksisuuntaista P-arvoa 0,05 tai vähemmän pidetään tilastollisesti merkitsevänä.

5. Tutkimuksen aikasuunnitelma/kehys i. Aikasuunnitelma Q/vuosi Toimenpiteet Q1 Virallisten asiakirjojen laatiminen näytteenottoa, tiedonkeruuta ja eettistä hyväksyntää varten sekä näytteen koon laskeminen kontrollille ja potilaille Q2 Näytteenotto potilailta valituilla kriteereillä ja seerumin erottaminen erissä Q3 Jatketaan näytteiden keräämistä ja erottelua. seerumi alikvooteissa + RNA:n uuttaminen näytteistä Q4 Kontrollinäytteiden kerääminen ja RNA:n uuttaminen Q1 cDNA-synteesi kaikille näytteille + qPCR Q2 Aineiston tilastollinen analyysi ja artikkelin kirjoittamisen aloittaminen + kokoelma aiheeseen liittyviä artikkeleita opinnäytetyötä varten Q3 Julkaisu paperi ja opinnäytetyön viimeistely tarkistettavaksi

ii. Paperin otsikko: "Tuumorisuppressorin tai onkogeenisten pienten biomarkkerien diagnostinen käyttö yhdessä LncRNA:n kanssa rintasyövässä"

Tekijät:

Marwa M. Mohamed, tohtori Eman Fouad Sanad, tohtori Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Vastaava lähettäjä: Prof. Nadia M. Hamdy Ensimmäinen kirjoittaja: Marwa M. Mohamed Osallistuja(t): Dr. Eman Fouad Sanad, tohtori Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Referenssiluettelo:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall ja J. Reen "Rintasyövän havaitseminen syväkonvoluutiohermoverkkojen ja tukivektorikoneiden avulla", PeerJ, voi. 7, s. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr ja J. A. Margenthaler, Molecular profiling of breast cancer, "Surgical Oncology Clinics of North America, voi. 23, ei. 3. Ss. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar, Metastaattisen rintasyövän hoito, julkaisussa JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, voi. 12, ei. 5 SUPPL., s. 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith ja D. C. Tomlinson, "Multidrug-resistentti rintasyöpä: nykyiset näkökulmat", "Breast Cancer: Targets and Therapy, voi. 6, ei. 0. Pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal et ai., "Somaattisten mutaatioiden maisema 560 rintasyövän koko genomisekvenssissä", "Nature, voi. 534, nro 7605, s. 47-54, 2016.
6. M. T. Maurano et ai., "Systematicc localization of common disease-associated variation in regulatory DNA", Science (80-.), voi. 337, nro 6099, s. 1190-1195, 2012.
7. M. V. Iorio ja C. M. Croce, "MicroRNA dysregulation in cancer: Diagnostics, monitoring andtherapys. Kattava katsaus, "EMBO Molecular Medicine, voi. 4, ei. 3. Ss. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi ja D. P. Bartel, "The Impact of microRNAs on protein output", "Nature, voi. 7209, s. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim et ai., "Microarray-analyysi osoittaa, että jotkin mikroRNA:t säätelevät alaspäin suuria määriä kohde-mRNA:ita, "Nature, voi. 433, nro 7027, s. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya ja N. Sonenberg, "Mechanisms of post-transkriptional regula by microRNAs: Are the Answers in sight?" Nature Reviews Genetics, voi. 9, ei. 2. Ss. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller ja H. A. Coller "Konservoituneiden sekvenssien etsintä koodaavilla alueilla paljastaa, että let-7-mikroRNA kohdistuu Diceriin koodaavassa sekvenssissään, "Proc. Natl. Acad. Sci., voi. 105, nro. 39, s. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong ja J. A. Steitz, "Switching from repression to activation: MicroRNAs can up-regulate translation", "Science (80-.)., voi. 318, nro 5858, s. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek ja A. T. Remaley, "MikroRNA:t kuljetetaan plasmassa ja toimitetaan vastaanottajasoluihin suuritiheyksisten lipoproteiinien avulla, "Nat. Cell Biol., voi. 13, ei. 4, s. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee ja J. O. Lotvall, "MRNA:n ja mikroRNA:iden eksosomivälitteinen siirto on uusi mekanismi solujen väliseen genaattiseen vaihtoon. "Nat. Cell Biol., voi. 9, ei. 6, s. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg et ai., "Funcional delivery of viral miRNAs via exosomes", "Proc. Natl. Acad. Sci., voi. 107, nro. 14, s. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz ja B. Burwinkel, "Extracellular miRNAs: The mystery of their origin and function", "Trends Biochem. Sci., voi. 37, nro. 11, s. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin ja F. J. Slack, "Totuusseerumi syöpää varten ---- mikroRNA:illa on suuri potentiaali syövän biomarkkereina", Cell Res., voi. 18, ei. 10, s. 983-984, 2008.
18. Lu et al, "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research" (2018)
19. Cui, L. et ai. MicroRNA-301a:n ilmentyminen ja sen toiminnalliset roolit pahanlaatuisessa melanoomassa. Cellular physiology and biochemistry: kansainvälinen kokeellisen solufysiologian, biokemian ja farmakologian aikakauslehti 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. MicroRNA-301a:n lisääntynyt ilmentyminen ei-pienisoluisessa keuhkosyöpässä ja sen kliininen merkitys. Journal of Cancer Research and Therapedies 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et ai. miR-301a edistää haimasyöpäsolujen lisääntymistä estämällä suoraan Bim-ilmentymistä. Journal of cellular biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et ai. Tuumorigeneesin modulointi pro-inflammatorisella mikroRNA miR-301a:lla keuhkosyövän ja paksusuolen syövän hiirimalleissa. Cell Discovery 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski ja H. Y. Chang, "Long noncoding RNAs and human disease", Trends in Cell Biology, voi. 21, nro 6. s. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov ja I. Berindan-Neagoe, "Targeting ncRNAs by kasvin sekundääriset metaboliitit: ncRNAs peli tasapainossa maligniteetin estoon, Biotechnology advances, voi. 36, nro. 6. Ss. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo ja R. Johnson, "The long non-coding rnas: A new (p)layer in the Dark Material, "Frontiers in Genetics, voi. 2, ei. tammikuuta 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 on vuorovaikutuksessa miR-765:n kanssa ja moduloi kielen levyepiteelikarsinooman etenemistä kohdistamalla LAMC2:een. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 toimii kilpailevana endogeenisenä RNA:na säätelemään VEGFA:n ilmentymistä hsa-miR-29b-3p:n kautta haiman tiehyen adenokarsinoomassa. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim et ai., "Ultraäänilöytöjen korrelaatio histologian, kasvaimen asteen ja biologisten merkkiaineiden kanssa rintasyövässä", "ActaOncol. (Madar)., voi. 47, nro. 8, s. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig ja G. Campbell, "Receiver-operating character (ROC) plots: Fundamentaalinen arviointityökalu kliinisessä lääketieteessä, "Clinical Chemistry, voi. 39, ei. 4. Ss. 561-577, 1993.

(30) Hu, Z. B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) Seerumin mikroRNA-profilointi ja rinta syöpäriski: miR-484/191:n käyttö endogeenisinä kontrolleina. Carcinogenesis, 33, 828-834.