LINC00511/miR-185-3p-Achse und miR-301a-3p-Marker für die Brustkrebsdiagnose

1. Einleitung 1.1. Hintergrund: Brustkrebs ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen für Frauen. Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird die Zahl der Krebsfälle im Jahr 2025 voraussichtlich 19,3 Millionen Fälle betragen. In Ägypten stellt Krebs ein zunehmendes Problem dar, insbesondere Brustkrebs [1].

   Brustkrebs ist der häufigste bösartige Tumor bei Frauen und stellt eine große Bedrohung für die Gesundheit von Frauen dar. Seine Entwicklung ist mit einer äußerst aggressiven lokalen Invasion, frühen Metastasen und einer Multiresistenz gegen Chemotherapie verbunden [2, 3]. Daher sind Entwicklungen minimalinvasiver Marker zur Früherkennung von Brustkrebs von großem Interesse.

   Der Krebsgenomatlas (TCGA) ergab, dass viele der bei Krebs vorkommenden Mutationen und Kopienzahländerungen nicht mit Protein-kodierenden Genen überlappen [4], sondern häufig in nicht-kodierenden DNA-Genen lokalisiert sind, einschließlich nicht-kodierender RNA-Gene [5]. . MicroRNAs (miRNAs) gehörten zu den ersten nicht-kodierenden RNAs, die bei Krebs und ihrer Rolle als therapeutische Ziele oder Biomarker bei Krebs untersucht wurden [6].

   MiRNAs sind kurze, einzelsträngige RNA-Sequenzen (normalerweise 19–23 Nukleotide), die die Genexpression in einer Vielzahl von physiologischen und entwicklungsbezogenen Prozessen steuern und somit eine entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Regulierung der Genexpression in einem breiten Spektrum biologischer Systeme spielen [7, 8]. MiRNAs vermitteln die Repression der Ziel-mRNA durch Basenpaarung mit komplementären Sequenzen in der 3'-UTR, was zu einer Destabilisierung des Transkripts, einer Translationsrepression oder beidem führt [9]. Es wurde berichtet, dass miRNAs auch die Genexpression modulieren, indem sie an andere Regionen, einschließlich proteinkodierender Exons, binden [10], und sogar die Genexpression in Säugetierzellen induzieren können [11].

   Zellfreie zirkulierende miRNAs sind normalerweise an Ribonukleoproteinkomplexe oder hochdichtes Lipoprotein gebunden oder werden von Zellen in Lipidvesikeln, Mikrovesikeln, Exosomen oder apoptotischen Körpern freigesetzt [12–15]. Daher können zirkulierende miRNAs die homöostatische Reaktion der Zellen widerspiegeln Organismus sowie Anzeichen eines Krankheitsverlaufs. Aufgrund ihrer Stabilität und Resistenz gegenüber endogener RNAse-Aktivität wurden diese miRNAs als diagnostische und prognostische Biomarker für Krankheiten, einschließlich Krebs, vorgeschlagen [16].

   Unter diesen miRNAs wurde MiR-185-3p als Tumorsuppressorgen bei verschiedenen Krebsarten identifiziert. Die Expression von miR-185-3p war in den Brustkrebszellen MDA-MB-231 und MCF-7 verringert. Darüber hinaus wurde miR-185-3p in der zum Schweigen gebrachten LINC00511-Transfektion überexprimiert, während es in der verstärkten LINC00511-Plasmidtransfektion abnahm [17].

   MicroRNA-301a ist ein weiterer oncomiR, der mit dem Tumorwachstum bei mehreren Krebsarten in Zusammenhang steht. Beispielsweise bei Prostatakrebs, Magenkrebs sowie Bauchspeicheldrüsenkrebs [18-21]. Allerdings ist seine Rolle bei Brustkrebs noch nicht vollständig erforscht.

   Lange nichtkodierende RNA (LncRNAs) sind solche, die länger als 200 Nukleotide sind, und viele von ihnen können auch als primäre Transkripte zur Produktion kurzer RNAs fungieren. Im Allgemeinen sind LncRNAs an Genregulationsfunktionen beteiligt, beispielsweise an der Kompensation der Chromatindosis, der Prägung, der epigenetischen Regulierung, der Kontrolle des Zellzyklus, dem nuklearen und zytoplasmatischen Transport und der Zelldifferenzierung (22). Darüber hinaus kommt es zu einer Prä-mRNA-Interaktion, bei der das Primärtranskript mit LncRNAs interagiert und eine andere funktionelle Spleißsequenz erhält oder in endogene kleine interferierende RNAs, miRNA-Schwämme, Modulation der Proteinaktivität oder Lokalisierung und Erleichterung der Bildung von Riboproteinkomplexen abgebaut wird. Nicht zuletzt können LncRNAs als Vorläufer für kleinere Fragmente wie miRNAs oder piRNAs dienen. Die Hauptfunktion von ciRNAs besteht darin, dass miRNAs durch komplementäre Wechselwirkungen eingefangen werden und wie ein miRNA-Schwamm funktionieren [23]. LncRNAs wurden bereits mit menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht [24].

   Lange intergene nichtkodierende RNA 00511 (LINC00511); ist ein Onkogen, das die Tumorgröße, Metastasierung und schlechte Prognose beeinflusst. LINC00511 bindet die Histon-Methyltransferase EZH2 und spezifiziert das Histon-Modifikationsmuster auf p57 [25]. Es wirkt auch als Onkogen bei Plattenepithelkarzinomen und duktalen Adenokarzinomen des Pankreas [26]. Insbesondere ist wenig darüber bekannt, ob LncRNAs als Biomarker für die Krebsprognose oder -diagnose dienen können. [27] 1.2. Problem: Die Rolle dieser Biomarker bei der Früherkennung von Brustkrebs ist noch nicht erforscht.

   1.3. Hypothese: Tumorsuppressor oder onkogene Biomarker und LncRNA werden bei der Frühdiagnose von Brustkrebs eingesetzt“

2. Ziel der Arbeit:

   Das ultimative Ziel der Arbeit besteht darin, ein klareres Bild der Funktionen von miR-185-3p, miR-301a in Verbindung mit LINC00511 bei der Frühdiagnose von Brusttumoren zu liefern und dabei sowohl Sensitivität als auch Spezifität zu messen.

3. Ergebnisse früherer Studien: auf einer halben Seite. Bisher wurden keine klinischen Studien zum Aspekt der diagnostischen Nützlichkeit der untersuchten Biomarker durchgeführt.

4. Problemstellung:

   Die Rolle dieser Biomarker bei der Früherkennung von Brustkrebs bei ägyptischen Patientinnen wurde noch nicht untersucht.

5. Forschungsbedeutung:

Primäres Ergebnis:

• Um peripher im Blut zirkulierende Tumorsuppressoren oder onkogene kleine Biomarker für Brustkrebs zu identifizieren und mit der normalen Kontrollexpression zu vergleichen

Sekundäres Ergebnis:

• Zur Berechnung der Sensitivität und Spezifität von miR-185-3p, miR-301a und LINC00511 im Vergleich zu den proteinbasierten Markern (CEA und CA15-3) als diagnostische Marker.

6. Forschungsziele:

1. Analysieren Sie das Expressionsniveau von zwei miRNA (miR-185-3p, miR-301a) und ihrer vorhergesagten interagierten lncRNA (LINC00511) als minimale nichtinvasive molekulare Marker für die Diagnose des primären Brustkrebses.
2. Vergleichen Sie miR-185-3p, miR-301a und LINC00511 mit den proteinbasierten Markern (CEA und CA15-3) als diagnostische Marker hinsichtlich Sensitivität und Spezifität.
3. Untersuchen Sie die Beziehung zwischen miR-185-3p, miR-301a und LINC00511 und die klinisch-pathologischen Merkmale von Brustkrebs.
4. Forschungsmethodik:

Diese Studie wird zunächst von der Ethikkommission der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams-Universität und von der Ethikkommission des National Cancer Institute in New Cairo genehmigt. Darüber hinaus wird es in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt, wobei zwei Gruppen einbezogen werden und alle Probanden ihre schriftliche Zustimmung zur Archivierung geben.

Gruppe 1, die Kontrollgruppe: Insgesamt 50 gesunde Freiwillige, bei denen es sich um gleichaltrige gesunde weibliche Freiwillige handelt, die weder an einer Krankheit leiden noch Medikamente einnehmen.

Gruppe 2 (Maligner Brusttumor): 50 Frauen mit nicht metastasiertem primärem Brustkrebs. Kürzlich diagnostizierte Patientinnen, die noch keine Chemotherapie oder Strahlentherapie erhalten haben, besuchen das National Cancer Institute, New Cairo.

Für alle Fälle und Kontrollen wird eine vollständige Anamnese erhoben. Für die Datenanalyse werden die Merkmale der Brustkrebspatientinnen in Bezug auf Alter, Menopausenstatus, histopathologischer Typ, Tumorgröße, Lymphknotenmetastasierung und Tumorgrad sowie Östrogenrezeptor (ER) und Progesteronrezeptor (PR) erfasst.

Ausschlusskriterien

Patienten mit:

• Blutkrankheiten, - alle Krebsarten außer Brustkrebs
• Leberzirrhose, Gebärmutter- und Harnblasenerkrankungen

Methoden:

Routinearbeit:

Blutprobe:

Zur Serumvorbereitung werden 5 ml Blut in einfache Vaccutainer-Röhrchen gesammelt. Serumproben werden bis zur biochemischen Beurteilung im Forschungslabor der Biochemieabteilung der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams University bei -80 °C gelagert.

Test von miR-185-3p, miR-301a und LINC00511 durch quantitative PCR:

MiRNA und LncRNAs werden mit dem Qiagen miRNeasy Mini Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers aus dem Serum extrahiert und ihre Konzentration und Reinheit werden mit einem Nanotropfen-Spektrophotometer erfasst.

Angereicherte RNA wird mit dem Reverse-Transkriptionskit miroRNA oder LncRNAs gemäß dem Protokoll des Herstellers revers transkribiert.

Die Expression von miRNA und LncRNAs wird durch qRT-PCR unter Verwendung von humanen MicroRNA- und LncRNAs-Assay-Kits und ihren spezifischen Primern quantifiziert.

Die Expressionsniveaus der untersuchten miRNA werden mit der ∆Ct-Methode bewertet [28]. Der Zyklusschwellenwert (Ct) ist die Anzahl der qPCR-Zyklen, die erforderlich sind, damit das Fluoreszenzsignal einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. ∆Ct wird berechnet, indem die Ct-Werte von RNU6-2 und GAPDH von denen der untersuchten miRNAs bzw. LncRNAs subtrahiert werden. Der ∆∆Ct wird berechnet, indem der ∆Ct der Kontrollproben vom ∆Ct der Krebsproben subtrahiert wird.

Untersuchung von Hormonrezeptoren und proteinbasierten Tumormarkern: Sowohl der Östrogenrezeptor, der Progesteronrezeptor als auch der humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER-2neu) sowie CEA- und CA15.3-Tumormarker unter Verwendung von ELISA-Kits werden vom National Cancer Institute bezogen , Neu-Kairo.

SCHÄTZUNG DER PROBENGRÖSSE Ziel dieser Studie ist es, die Rolle einiger zirkulierender MiRNAs aus unabhängigen Kontroll- und Brustkrebsfällen mit 1 Kontrolle pro Versuchsperson zu untersuchen. Basierend auf einer früheren Studie (Hu et al. 2012) war die Expression kleiner onkogener Biomarker normalverteilt mit einer Standardabweichung von 2,9 und einer großen Effektgröße (1,09). Wenn die wahren Unterschiede in den Mittelwerten der Brustkrebsgruppe und der Kontrollgruppe 2,25 betragen, müssen wir 25 Versuchspersonen und 25 Kontrollpersonen untersuchen, um die Nullhypothese zurückweisen zu können, dass die Populationsmittelwerte der Versuchs- und Kontrollgruppe mit der Wahrscheinlichkeit gleich sind ( Leistung) 0,8. Die mit diesem Test dieser Nullhypothese verbundene Fehlerwahrscheinlichkeit vom Typ I beträgt 0,05.

Was die Tumorsuppressor-Expression betrifft, war der Mittelwert normalverteilt mit großer Effektgröße (1,4). Wenn die wahren Unterschiede in den Mittelwerten der Brustkrebsgruppe und der Kontrollgruppe 14 betragen, müssen wir 15 Versuchspersonen und 15 Kontrollpersonen untersuchen, um die Nullhypothese zurückweisen zu können, dass die Populationsmittelwerte der Versuchs- und Kontrollgruppe mit der Wahrscheinlichkeit gleich sind ( Leistung) 0,8. Die mit diesem Test dieser Nullhypothese verbundene Fehlerwahrscheinlichkeit vom Typ I beträgt 0,05.

Die Gesamtstichprobengröße beträgt 80 Fälle, diese Zahl wird bei erwarteten Verlusten um 25 % erhöht und die Gesamtstichprobe beträgt 100 Probanden, 50 Probanden pro Gruppe.

Die Schätzung der Stichprobengröße wurde mit dem G-Power*-Stichprobengrößenrechner durchgeführt.

Statistische Analyse:

Zur Durchführung der statistischen Analysen wird das Softwarepaket SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL) verwendet. T-Test oder Mann-Whitney-U-Test werden verwendet, um die Differenz kontinuierlicher Variablen in zwei Gruppen zu vergleichen, je nach Bedarf. Zum Vergleich der Unterschiede zwischen kategorialen Variablen werden die Chi-Quadrat-Analyse nach Pearson oder der exakte Test nach Fisher verwendet. Die ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) und die Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) werden aufgezeichnet, um den besten Grenzwert zu bestimmen, der zwischen Krebs- und Nichtkrebsgruppen unterscheidet. Die Sensitivitäten und Spezifitäten werden für die miRNAs und ihre diagnostische Wirksamkeit berechnet. Für alle Analysen wird ein zweiseitiger P-Wert von 0,05 oder weniger als statistisch signifikant angesehen.

5. Forschungszeitplan/-rahmen i. Zeitplan Q/Jahr Aktionen Q1 Vorbereitung der offiziellen Dokumente für Probenentnahme, Datenerfassung und ethische Genehmigung und Berechnung der Probengröße für Kontrolle und Patienten Q2 Probenentnahme von Patienten mit ausgewählten Kriterien und Trennung des Serums in Aliquots Q3 Fortsetzung der Probenentnahme und Trennung von Serum in Aliquots + Extraktion von RNA aus den Proben Q4 Sammlung von Kontrollproben und Extraktion von RNA Q1 cDNA-Synthese für alle Proben + qPCR Q2 Statistische Analyse der Daten und Beginn des Schreibens einer Arbeit + Sammlung verwandter Artikel für das Verfassen einer Abschlussarbeit Q3 Veröffentlichung von der Arbeit und die Fertigstellung der Arbeit zur Überarbeitung

ii. Titel der Arbeit: „Der diagnostische Nutzen von Tumorsuppressoren oder onkogenen kleinen Biomarkern in Verbindung mit LncRNA bei Brustkrebs“

Autoren:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Korrespondierender einreichender Autor: Prof. Nadia M. Hamdy Erster Autor: Marwa M. Mohamed Mitwirkender Autor(en): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

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