LINC00511/miR-185-3p Axis og miR-301a-3p markører til brystkræftdiagnose

1. Indledning 1.1. Baggrund: Brystkræft er en af ​​de førende dødsårsager for kvinder globalt, ifølge verdenssundhedsorganisationen (WHO) vil antallet af kræfttilfælde, der forventes i 2025, være 19,3 millioner tilfælde. I Egypten er kræft et stigende problem og især brystkræft [1].

   Brystkræft er den mest almindelige kvindelige maligne tumor og en stor trussel mod kvinders sundhed, og dens udvikling er betydeligt aggressiv lokal invasion, tidlige metastaser og multilægemiddelresistens over for kemoterapi [2, 3]. Derfor er udviklingen af ​​minimalt-invasive markører til tidlig påvisning af brystkræft af stor interesse.

   Kræftgenomet Atlas (TCGA) afslørede, at mange af mutationerne og kopiantalændringerne fundet i cancer ikke overlapper med proteinkodende gener [4], men er ofte lokaliseret i ikke-kodende DNA-herunder ikke-kodende RNA-gener [5] . MikroRNA'er (miRNA'er) var blandt de første ikke-kodende RNA'er, der blev undersøgt cancer, og deres roller som terapeutiske mål eller biomarkører i cancer [6].

   MiRNA'er er korte, enkeltstrengede RNA-sekvenser (normalt 19-23 nukleotider), der kontrollerer genekspression i en række forskellige fysiologiske og udviklingsmæssige processer, og har således en afgørende rolle i posttranskriptionel regulering af genekspression i en bred vifte af biologiske systemer [7, 8]. MiRNA'er medierer undertrykkelsen af ​​mål-mRNA ved baseparring til komplementær sekvens i 3'-UTR, hvilket forårsager transkript-destabilisering, translationel repression eller begge dele [9]. Det er blevet rapporteret, at miRNA'er også modulerer genekspression ved at binde til andre regioner, herunder proteinkodende exoner [10], og kan endda inducere genekspression i pattedyrsceller [11].

   Cellefrie cirkulerende miRNA'er eksisterer normalt bundet til ribonukleoprotienkomplekser eller højdensitetslipoprotein, eller de frigives fra celler i lipidvesikler, mikrovesikler, exosomer eller apoptotiske legemer [12-15]. Cirkulerende miRNA'er kan således afspejle homøostatisk respons fra organisme, samt tegn på sygdomsprogression. På grund af deres stabilitet og resistens over for endogen RNAse-aktivitet er disse miRNA'er blevet foreslået som diagnostiske og prognostiske biomarkører for sygdomme, herunder cancer [16].

   Blandt disse miRNA'er er MiR-185-3p blevet identificeret som et tumorsuppressorgen i forskellige typer kræft. Ekspressionen af ​​miR-185-3p blev reduceret i brystkræftcellerne MDA-MB-231 og MCF-7. Desuden blev miR-185-3p overudtrykt i den LINC00511-dæmpede transfektion, mens den var faldet i den forstærkede LINC00511-plasmidtransfektion [17].

   MicroRNA-301a er en anden oncomiR, der har været relateret til tumorprogression i flere typer kræft. For eksempel ved prostatacancer, gastrisk cancer samt bugspytkirtelkræft [18-21]. Imidlertid er dets rolle i brystkræft ikke fuldt ud undersøgt.

   Lange ikke-kodende RNA (LncRNA'er) er dem, der er længere end 200 nukleotider, og mange af dem kan også fungere som primære transkripter til at producere korte RNA'er. Generelt er LncRNA'er blevet impliceret i genregulerende roller, såsom chromatindosiskompensation, prægning, epigenetisk regulering, cellecykluskontrol, nuklear og cytoplasmatisk trafficking og celledifferentiering [22]. Ydermere præ-mRNA-interaktion, hvor det primære transkript interagerer med LncRNA'er og ender med en anden funktionel splejset sekvens eller nedbrydes til endogene små interfererende RNA'er, miRNA-svampe, modulering af proteinaktivitet eller lokalisering og facilitering af riboproteinkompleksdannelse. Ikke i det mindste kan LncRNA'er stå som forløbere for mindre fragmenter som miRNA'er eller piRNA'er. Hovedfunktionen af ​​ciRNA'er består i, at miRNA'er fanger gennem komplementære interaktioner, og fungerer som en miRNA-svamp [23]. LncRNA'er er allerede blevet impliceret i human sygdom, herunder cancer [24].

   Langt intergent ikke-kodende RNA 00511 (LINC00511); er et onkogen, der påvirker tumorstørrelse, metastaser og dårlig prognose. LINC00511 binder histonmethyltransferase EZH2 og specificerer histonmodifikationsmønsteret på p57 [25]. Det virker også som et onkogen i planocellulært karcinom og pancreas duktalt adenokarcinom [26]. Især er lidt kendt, om LncRNA'er kan tjene som biomarkører for kræftprognose eller diagnose. [27] 1.2. Problem: Disse biomarkørers rolle er endnu ikke undersøgt i tidlig diagnose af brystkræft.

   1.3. Hypotese: Tumor suppressor eller onkogene biomarkører og LncRNA brugt til tidlig diagnose af brystkræft"

2. Formålet med arbejdet:

   Det endelige mål med arbejdet er at give et klarere billede af funktionerne af miR-185-3p, miR-301a, i forbindelse med LINC00511 i den tidlige diagnose af brysttumorer med måling af både sensitivitet og specificitet.

3. Resultater fra tidligere undersøgelser: på halv side. Der blev ikke foretaget tidligere kliniske undersøgelser af aspektet af de undersøgte biomarkørers diagnostiske nytteværdier.

4. Problemformulering:

   Disse biomarkørers rolle er endnu ikke undersøgt i tidlig diagnose af brystkræft hos egyptiske patienter.

5. Forskningsmæssig betydning:

Primært resultat:

• At identificere perifer blodcirkulerende tumorundertrykker eller onkogene små biomarkører brystkræft og sammenligne med normal kontrolekspression

Sekundært resultat:

• At beregne sensitivitet og specificitet af miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 sammenlignet med de proteinbaserede markører (CEA og CA15-3) som diagnostiske markører.

6. Forskningsmål:

1. Analyser ekspressionsniveauet af to miRNA (miR-185-3p, miR-301a) og deres forudsagte interagerede lncRNA (LINC00511) som minimale ikke-invasive molekylære markører til diagnosticering af den primære brystkræft.
2. Sammenlign miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 med de proteinbaserede markører (CEA og CA15-3) som diagnostiske markører med hensyn til sensitivitet og specificitet.
3. Undersøg forholdet mellem miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 og de klinisk-patologiske karakterer af brystkræft.
4. Forskningsmetodik:

Denne undersøgelse vil først blive godkendt af Det Etiske Udvalg ved Det Farmaceutiske Fakultet, Ain Shams University og af Det Etiske Udvalg ved National Cancer Institute, New Cairo. Desuden vil det blive udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringens retningslinjer, hvor to grupper vil blive inkluderet, og alle forsøgspersoner vil give deres skriftlige samtykke til at blive arkiveret.

Gruppe 1 kontrolgruppen: I alt 50 raske frivillige, som er aldersvarende raske kvindelige frivillige, der ikke lider af nogen sygdom eller tager medicin.

Gruppe 2 (malign brysttumor): 50 kvinder med ikke-metastatisk primær brystkræft Patienter, der for nylig er diagnosticeret, og som endnu ikke har modtaget kemoterapi eller strålebehandling, går til National Cancer Institute, New Cairo.

Fuld historie vil blive taget for alle sager og kontrol. Brystkræftpatienternes karakteristika med hensyn til alder, menopausal status, histopatologisk type, tumorstørrelse, lymfeknudemetastaser og tumorgrad, samt østrogenreceptor (ER) og progesteronreceptor (PR) vil blive indsamlet til dataanalyse.

Eksklusionskriterier

Patienter med:

• Blodsygdomme, -Enhver anden kræft end brystkræft
• Levercirrhose, livmoder- og urinblæresygdomme

Metoder:

Rutinemæssigt arbejde:

Blodprøvetagning:

5 ml blod vil blive opsamlet i almindelige vaccutainerrør til serumforberedelse. Serumprøver vil blive opbevaret ved -80 ºC indtil biokemisk vurdering på Biochemistry Department Research Lab, Det Farmaceutiske Fakultet, Ain Shams University.

Assay af miR-185-3p, miR-301a og LINC00511 ved kvantitativ PCR:

MiRNA og LncRNA'er vil blive ekstraheret fra serum ved hjælp af Qiagen miRNeasy Mini Kit i henhold til producentens protokol, og deres koncentration og renhed vil blive påvist med nanodrop spektrofotometer.

Beriget RNA vil blive omvendt transskriberet med miroRNA eller LncRNAs omvendt transkriptionskit i henhold til producentens protokol.

Ekspression af miRNA og LncRNA'er vil blive kvantificeret ved qRT-PCR ved hjælp af humane MicroRNA og LncRNA'er assaykits og deres specifikke primere.

Ekspressionsniveauerne af det undersøgte miRNA vil blive evalueret ved hjælp af ∆Ct-metoden [28]. Cyklustærskelværdien (Ct) er antallet af qPCR-cyklusser, der kræves for, at det fluorescerende signal kan krydse en specifik tærskel. ∆Ct vil blive beregnet ved at subtrahere Ct-værdierne for RNU6-2 og GAPDH fra dem for henholdsvis undersøgte miRNA'er og LncRNA'er. ∆∆Ct vil blive beregnet ved at trække ∆Ct af kontrolprøverne fra ∆Ct af cancerprøverne.

Undersøgelse af hormonreceptorer og proteinbaserede tumormarkører: Både østrogenreceptor, progesteronreceptor og human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER-2neu) vil udover CEA- og CA15.3-tumormarkører ved hjælp af ELISA-sæt blive indhentet fra National Cancer Institute , New Cairo.

ESTIMATION AF PRØVESTØRRELSE Formålet med denne undersøgelse er at undersøge rollen for nogle cirkulerende MiRNA'er fra uafhængige kontrol- og brystkræfttilfælde med 1 kontrol pr. forsøgsperson. Baseret på tidligere undersøgelse (Hu et al. 2012) var den onkogene små biomarkørekspression normalfordelt med standardafvigelse 2,9 og stor effektstørrelse (1,09). Hvis de sande forskelle i brystkræftgruppen og kontrolgruppens gennemsnit er 2,25, bliver vi nødt til at studere 25 forsøgspersoner og 25 kontrolpersoner for at kunne afvise nulhypotesen om, at populationsgennemsnittene for forsøgs- og kontrolgruppen er lig med sandsynlighed ( effekt) 0,8. Type I fejlsandsynligheden forbundet med denne test af denne nulhypotese er 0,05.

Med hensyn til tumorsuppressor var ekspressionsmidlet normalt fordelt med stor effektstørrelse (1,4). Hvis de sande forskelle i brystkræftgruppen og kontrolgruppens middelværdier er 14, bliver vi nødt til at studere 15 forsøgspersoner og 15 kontrolpersoner for at kunne afvise nulhypotesen om, at populationsmiddelværdierne for forsøgs- og kontrolgruppen er lig med sandsynlighed ( effekt) 0,8. Type I fejlsandsynligheden forbundet med denne test af denne nulhypotese er 0,05.

Samlet stikprøvestørrelse vil være 80 tilfælde, dette antal vil blive øget med 25% for forventede tab, og den samlede prøve er 100 forsøgspersoner, 50 forsøgspersoner pr. gruppe.

Prøvestørrelsesestimation blev udført af G power* prøvestørrelsesberegner.

Statistisk analyse:

SPSS 21.0 softwarepakke (SPSS,Chicago,IL) vil blive brugt til at udføre de statistiske analyser. T-test eller Mann-Whitneys U-test vil blive brugt til at sammenligne forskellen mellem kontinuerte variable i to grupper efter behov. Pearsons Chi-square-analyse eller Fishers eksakte test vil blive brugt til at sammenligne forskellen mellem kategoriske variabler. Modtagerens driftskarakteristik (ROC) kurve og areal under ROC-kurven (AUC) vil blive plottet for at bestemme det bedste afskæringspunkt, der skelner mellem kræft- og ikke-kræftgrupper; sensitiviteter og specificiteter vil blive beregnet for miRNA'erne og deres diagnostiske effektivitet. For alle analyser vil en to-halet P-værdi på 0,05 eller mindre blive betragtet som statistisk signifikant.

5. Forskningstidsplan/ramme i. Tidsplan Q/år Handlinger Q1 Udarbejdelse af de officielle dokumenter til prøveindsamling, dataindsamling og etisk godkendelse samt beregning af prøvestørrelse for kontrol og patienter Q2 Prøveindsamling fra patienter med udvalgte kriterier og separering af serum i aliquoter Q3 Fortsætte prøveindsamling og adskillelse af serum i alikvoter + Ekstraktion af RNA fra prøverne Q4 Indsamling af kontrolprøver og Ekstraktion af RNA Q1 cDNA syntese for alle prøver + qPCR Q2 Statistisk analyse af dataene og begyndelse af at skrive et papir + samling af relaterede artikler til specialeskrivning Q3 Udgivelse af papiret og færdiggørelse af specialet til revision

ii. Papirtitel: "Den diagnostiske nytte af tumorundertrykkende eller onkogene små biomarkører i forbindelse med LncRNA i brystkræft"

Forfattere:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Tilsvarende indsendende forfatter: Prof. Nadia M. Hamdy Første forfatter: Marwa M. Mohamed Bidragende forfatter(e): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Referenceliste:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall og J. Reen,"Brystkræftdetektion ved hjælp af dybe foldede neurale netværk og understøttende vektormaskiner," PeerJ, vol. 7, s. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr og J. A. Margenthaler," Molecular profiling of breast cancer, "Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 23, nr. 3. pp. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar," Behandling af metastatisk brystkræft, "i JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, vol. 12, nr. 5 SUPPL., s. 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith og D. C. Tomlinson, "Multidrug-resistant breast cancer: Current perspectives", "Breast Cancer: Targets and Therapy, vol. 6, nr. 0. pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal et al., "Landskab af somatiske mutationer i 560 brystcancer hel-genomsekvenser", "Nature, vol. 534, nr. 7605, s. 47-54, 2016.
6. M. T. Maurano et al., "Systematisk lokalisering af almindelig sygdomsassocieret variation i regulatorisk DNA," Science (80-.), vol. 337, nr. 6099, s. 1190-1195, 2012.
7. M.V. Iorio og C.M. Croce, "MicroRNA-dysregulering i cancer: Diagnostik, overvågning og terapi. En omfattende gennemgang, "EMBO Molecular Medicine, vol. 4, nr. 3. pp. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi og D. P. Bartel, "The impact of microRNAs on protein output," Nature, vol. 7209, s. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim et al., "Microarray-analyse viser, at nogle mikroRNA'er nedregulerer et stort antal mål-mRNA'er," Nature, vol. 433, nr. 7027, s. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya og N. Sonenberg, "Mekanismer for post-transkriptionel regulering af mikroRNA'er: Er svarene i sigte?" Nature Reviews Genetics, vol. 9, nr. 2. pp. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller og H. A. Coller,"En søgning efter konserverede sekvenser i kodende regioner afslører, at let-7 mikroRNA'et målretter mod Dicer inden for dens kodende sekvens, "Proc. Natl. Acad. Sci., bind. 105, nr. 39, s. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong og J. A. Steitz, "Skift fra undertrykkelse til aktivering: MicroRNA'er kan opregulere oversættelse", "Science (80-.), vol. 318, nr. 5858, s. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek og A. T. Remaley, "MicroRNA'er transporteres i plasma og leveres til modtagerceller af high-denisty lipoproteiner," Nat. Cell Biol., vol. 13, nr. 4, s. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee og J. O. Lotvall, "Exosom-medieret overførsel af mRNA og mikroRNA'er er en ny mekanisme for genetisk udveksling mellem celler.", "Nat. Cell Biol., vol. 9, nr. 6, s. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg et al., "Funktionel levering af virale miRNA'er via exosomer", Proc. Natl. Acad. Sci., bind. 107, nr. 14, s. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz og B. Burwinkel, "Ekstracellulære miRNA'er: Mysteriet om deres oprindelse og funktion", "Trends Biochem. Sci., bind. 37, nr. 11, s. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin og F. J. Slack, "Et sandhedsserum for cancer ---- mikroRNA'er har et stort potentiale som cancerbiomarkører," Cell Res., vol. 18, nr. 10, s. 983-984, 2008.
18. Lu et al, "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research" (2018)
19. Cui, L. et al. Ekspression af MicroRNA-301a og dets funktionelle roller i malignt melanom. Cellulær fysiologi og biokemi: internationalt tidsskrift for eksperimentel cellulær fysiologi, biokemi og farmakologi 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. Øget ekspression af mikroRNA-301a i ikke-småcellet lungekræft og dens kliniske betydning. Journal of cancer research and therapeutics 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et al. miR-301a fremmer proliferation af bugspytkirtelkræftceller ved direkte at hæmme Bim-ekspression. Journal of cellular biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et al. Modulation af tumorigenese af det pro-inflammatoriske mikroRNA miR-301a i musemodeller af lungekræft og kolorektal cancer. Cell discovery 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski og H. Y. Chang, "Long noncoding RNAs and human disease," Trends in Cell Biology, vol. 21, nr.6. pp. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov og I. Berindan-Neagoe, "Targeting ncRNAs by plant secondary metabolites: The ncRNAs game in balance to malignancy inhibition,"Biotechnology advances, vol. 36, nr. 6. S. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo og R. Johnson, "The long non-coding rnas: A new (p)layer in the dark matter," Frontiers in Genetics, vol. 2, nr. januar 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 interagerer med miR-765 og modulerer tungepladecellekræftprogression ved at målrette mod LAMC2. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 fungerer som et konkurrerende endogent RNA til at regulere VEGFA-ekspression gennem sponging af hsa-miR-29b-3p i pancreas duktalt adenokarcinom. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim et al., "Korrelation af ultralydsresultater med histologi, tumorgrad og biologiske markører i brystkræft," ActaOncol. (Madar), bind. 47, nr. 8, s. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig og G. Campbell, "Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine, "Clinical Chemistry, vol. 39, nr. 4. S. 561-577, 1993.

(30)Hu, Z.B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) Serum mikroRNA profilering og bryst kræftrisiko: brugen af ​​miR-484/191 som endogene kontroller. Carcinogenesis, 33, 828-834.