Oś LINC00511/miR-185-3p i markery miR-301a-3p do diagnostyki raka piersi

1. Wprowadzenie 1.1. Kontekst: Rak piersi jest jedną z głównych przyczyn zgonów kobiet na całym świecie. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) przewidywana liczba przypadków raka w 2025 r. wyniesie 19,3 miliona przypadków. W Egipcie coraz większym problemem są nowotwory, zwłaszcza rak piersi [1].

   Rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym kobiet i poważnym zagrożeniem dla zdrowia kobiet, a jego rozwój charakteryzuje się szczególnie agresywną inwazją miejscową, wczesnymi przerzutami i wielolekową opornością na chemioterapię [2, 3]. Dlatego też dużym zainteresowaniem cieszą się opracowania małoinwazyjnych markerów wczesnego wykrywania raka piersi.

   Atlas genomu nowotworu (TCGA) ujawnił, że wiele mutacji i zmian w liczbie kopii stwierdzonych w przypadku raka nie pokrywa się z genami kodującymi białka [4], ale często jest zlokalizowanych w niekodującym DNA, w tym w niekodujących genach RNA [5] . MikroRNA (miRNA) były jednymi z pierwszych niekodujących RNA, które badano pod kątem nowotworu oraz ich roli jako celów terapeutycznych lub biomarkerów w nowotworach [6].

   MiRNA to krótkie, jednoniciowe sekwencje RNA (zwykle 19–23 nukleotydów), które kontrolują ekspresję genów w różnorodnych procesach fizjologicznych i rozwojowych, odgrywając tym samym kluczową rolę w potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów w szerokim zakresie układów biologicznych [7, 8]. MiRNA pośredniczą w represji docelowego mRNA poprzez parowanie zasad z sekwencją komplementarną w 3'-UTR, powodując destabilizację transkryptu, represję translacyjną lub jedno i drugie [9]. Donoszono, że miRNA modulują także ekspresję genów poprzez wiązanie się z innymi regionami, w tym eksonami kodującymi białka [10], a nawet mogą indukować ekspresję genów w komórkach ssaków [11].

   Krążące bezkomórkowo miRNA zwykle istnieją związane z kompleksami rybonukleoproteinowymi lub lipoproteinami o dużej gęstości lub są uwalniane z komórek w pęcherzykach lipidowych, mikropęcherzykach, egzosomach lub ciałach apoptotycznych [12-15]. Zatem krążące miRNA mogą odzwierciedlać odpowiedź homeostatyczną organizmu, a także oznaki postępu choroby. Ze względu na swoją stabilność i odporność na aktywność endogennej RNAzy, miRNA te zaproponowano jako biomarkery diagnostyczne i prognostyczne chorób, w tym nowotworów [16].

   Spośród tych miRNA zidentyfikowano MiR-185-3p jako gen supresorowy nowotworu w różnych typach nowotworów. Ekspresja miR-185-3p była zmniejszona w komórkach raka piersi MDA-MB-231 i MCF-7. Co więcej, miR-185-3p ulegał nadekspresji w wyciszonej transfekcji LINC00511, podczas gdy obniżył się w przypadku wzmocnionej transfekcji plazmidu LINC00511 [17].

   MicroRNA-301a to kolejny oncomiR powiązany z progresją nowotworu w kilku typach nowotworów. Np. w raku prostaty, raku żołądka, a także raku trzustki [18-21]. Jednak jego rola w raku piersi nie jest w pełni zbadana.

   Długie niekodujące RNA (LncRNA) to te dłuższe niż 200 nukleotydów, a wiele z nich może również działać jako pierwotne transkrypty w celu wytworzenia krótkich RNA. Ogólnie rzecz biorąc, LncRNA powiązano z rolami regulacyjnymi genów, takimi jak kompensacja dawki chromatyny, imprinting, regulacja epigenetyczna, kontrola cyklu komórkowego, transport jądrowy i cytoplazmatyczny oraz różnicowanie komórek [22]. Ponadto interakcja pre-mRNA, w której pierwotny transkrypt oddziałuje z LncRNA i kończy się inną funkcjonalną sekwencją splicingu lub jest degradowany do endogennych małych interferujących RNA, gąbek miRNA, modulacja aktywności białka lub lokalizacja i ułatwianie tworzenia kompleksu ryboproteinowego. Bynajmniej, LncRNA mogą służyć jako prekursory dla mniejszych fragmentów, takich jak miRNA lub piRNA. Główną funkcją ciRNA jest wychwytywanie miRNA poprzez interakcje komplementarne, funkcjonując jak gąbka miRNA [23]. LncRNA powiązano już z chorobami człowieka, w tym rakiem [24].

   Długi międzygenowy niekodujący RNA 00511 (LINC00511); jest onkogenem wpływającym na wielkość guza, przerzuty i złe rokowanie. LINC00511 wiąże metylotransferazę histonową EZH2 i określa wzór modyfikacji histonów na p57 [25]. Działa także jako onkogen w raku płaskonabłonkowym i gruczolakoraku przewodowym trzustki [26]. W szczególności niewiele wiadomo, czy LncRNA mogą służyć jako biomarkery w prognozowaniu lub diagnostyce raka. [27] 1.2. Problem: Rola tych biomarkerów we wczesnej diagnostyce raka piersi nie została jeszcze zbadana.

   1.3. Hipoteza: supresor nowotworu lub biomarkery onkogenne i LncRNA stosowane we wczesnej diagnostyce raka piersi”

2. Cel pracy:

   Ostatecznym celem pracy jest uzyskanie wyraźniejszego obrazu funkcji miR-185-3p, miR-301a w połączeniu z LINC00511 we wczesnej diagnostyce nowotworów piersi z pomiarem zarówno czułości, jak i swoistości.

3. Wyniki poprzednich badań: na pół strony. Nie prowadzono dotychczas badań klinicznych w aspekcie przydatności diagnostycznej badanych biomarkerów.

4. Opis problemu:

   Rola tych biomarkerów we wczesnej diagnostyce raka piersi u egipskich pacjentek nie została jeszcze zbadana.

5. Znaczenie badawcze:

Główny wynik:

• Aby zidentyfikować raka piersi krążącego w krwi obwodowej supresora guza lub onkogennego małego biomarkera i porównać go z prawidłową ekspresją kontrolną

Wynik wtórny:

• Aby obliczyć czułość i swoistość miR-185-3p, miR-301a i LINC00511 w porównaniu z markerami białkowymi (CEA i CA15-3) jako markerami diagnostycznymi.

6. Cele badawcze:

1. Przeanalizuj poziom ekspresji dwóch miRNA (miR-185-3p, miR-301a) i ich przewidywanego, oddziałującego lncRNA (LINC00511) jako minimalnych nieinwazyjnych markerów molekularnych do diagnozowania pierwotnego raka piersi.
2. Porównaj miR-185-3p, miR-301a i LINC00511 z markerami białkowymi (CEA i CA15-3) jako markerami diagnostycznymi pod względem czułości i swoistości.
3. Zbadaj związek między miR-185-3p, miR-301a i LINC00511 a kliniczno-patologicznymi cechami raka piersi.
4. Metodologia Badań:

Badanie to zostanie najpierw zatwierdzone przez Komisję Etyczną Wydziału Farmacji Uniwersytetu Ain Shams oraz Komisję Etyczną Narodowego Instytutu Raka w Nowym Kairze. Ponadto zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Wytycznych Helsińskich, gdzie zostaną uwzględnione dwie grupy, a wszyscy badani wyrażą pisemną zgodę na archiwizację.

Grupa 1. Grupa kontrolna: Łącznie 50 zdrowych ochotniczek, które są zdrowymi ochotniczkami w tym samym wieku, które nie cierpią na żadną chorobę ani nie przyjmują żadnych leków.

Grupa 2 (złośliwy nowotwór piersi): 50 kobiet z pierwotnym rakiem piersi bez przerzutów. Pacjenci niedawno zdiagnozowani, którzy nie otrzymali jeszcze żadnej chemioterapii ani radioterapii, przebywający w Narodowym Instytucie Raka w Nowym Kairze.

We wszystkich przypadkach zostanie zebrana pełna historia i kontrola. Do analizy danych zostanie zebrana charakterystyka pacjentek chorych na raka piersi pod względem wieku, stanu menopauzalnego, typu histopatologicznego, wielkości guza, przerzutów do węzłów chłonnych i stopnia zaawansowania nowotworu, a także receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PR).

Kryteria wyłączenia

Pacjenci z:

• Choroby krwi, -Jakikolwiek nowotwór inny niż rak piersi
• Marskość wątroby, choroby macicy i pęcherza moczowego

Metody:

Rutynowa praca:

Pobieranie próbek krwi:

5 ml krwi zostanie pobrane do zwykłych probówek próżniowych w celu przygotowania surowicy. Próbki surowicy będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu oceny biochemicznej w Laboratorium Badawczym Departamentu Biochemii na Wydziale Farmaceutycznym Uniwersytetu Ain Shams.

Test miR-185-3p, miR-301a i LINC00511 metodą ilościowej PCR:

MiRNA i LncRNA zostaną wyekstrahowane z surowicy przy użyciu zestawu Qiagen miRNeasy Mini Kit zgodnie z protokołem producenta, a ich stężenie i czystość zostaną wykryte za pomocą spektrofotometru nanokropelkowego.

Wzbogacone RNA zostanie poddane odwrotnej transkrypcji za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji miroRNA lub LncRNAs zgodnie z protokołem producenta.

Ekspresja miRNA i LncRNA zostanie oznaczona ilościowo metodą qRT-PCR przy użyciu zestawów do testów ludzkich MicroRNA i LncRNA oraz ich specyficznych starterów.

Poziom ekspresji badanego miRNA będzie oceniany metodą ∆Ct [28]. Wartość progu cyklu (Ct) to liczba cykli qPCR wymaganych, aby sygnał fluorescencyjny przekroczył określony próg. ∆Ct zostanie obliczone poprzez odjęcie wartości Ct RNU6-2 i GAPDH od wartości odpowiednio badanych miRNA i LncRNA. ∆∆Ct zostanie obliczone poprzez odjęcie ∆Ct próbek kontrolnych od ∆Ct próbek nowotworu.

Badanie receptorów hormonalnych i białkowych markerów nowotworowych: Zarówno receptor estrogenowy, progesteronowy, jak i receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER-2neu), a także markery nowotworowe CEA i CA15.3 przy użyciu zestawów ELISA zostaną uzyskane z National Cancer Institute , Nowy Kair.

OSZACOWANIE WIELKOŚCI PRÓBKI Celem tego badania jest zbadanie roli niektórych krążących MiRNA z niezależnych przypadków kontrolnych i przypadków raka piersi z 1 grupą kontrolną na osobę eksperymentalną. Na podstawie wcześniejszych badań (Hu i in. 2012) ekspresja onkogennych małych biomarkerów miała rozkład normalny z odchyleniem standardowym 2,9 i dużą wielkością efektu (1,09). Jeśli prawdziwe różnice w grupie chorych na raka piersi i średnich w grupie kontrolnej wynoszą 2,25, będziemy musieli zbadać 25 osób eksperymentalnych i 25 osób kontrolnych, aby móc odrzucić hipotezę zerową, że średnie populacji grup eksperymentalnych i kontrolnych są równe z prawdopodobieństwem ( moc) 0,8. Prawdopodobieństwo błędu typu I związane z tym testem tej hipotezy zerowej wynosi 0,05.

Jeśli chodzi o supresor nowotworu, średnie ekspresje miały rozkład normalny z dużą wielkością efektu (1,4). Jeśli prawdziwe różnice w grupie chorych na raka piersi i średnich w grupie kontrolnej wynoszą 14, będziemy musieli zbadać 15 osób eksperymentalnych i 15 osób kontrolnych, aby móc odrzucić hipotezę zerową, że średnie populacji grupy eksperymentalnej i kontrolnej są równe z prawdopodobieństwem ( moc) 0,8. Prawdopodobieństwo błędu typu I związane z tym testem tej hipotezy zerowej wynosi 0,05.

Całkowita wielkość próby wyniesie 80 przypadków, liczba ta zostanie zwiększona o 25% w przypadku oczekiwanych strat, a całkowita próba będzie wynosić 100 osób, po 50 osób w grupie.

Oszacowanie wielkości próby przeprowadzono za pomocą kalkulatora wielkości próbki G-power*.

Analiza statystyczna:

Do przeprowadzenia analiz statystycznych zostanie wykorzystany pakiet oprogramowania SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL). Do porównania różnicy zmiennych ciągłych w dwóch grupach zostanie zastosowany, odpowiednio, test T lub test U Manna-Whitneya. Do porównania różnicy zmiennych kategorycznych zostanie zastosowana analiza chi-kwadrat Pearsona lub dokładny test Fishera. Krzywa charakterystyki działania odbiornika (ROC) i obszar pod krzywą ROC (AUC) zostaną wykreślone w celu określenia najlepszego punktu odcięcia, który rozróżnia grupy z nowotworem i grupy nienowotworowe; dla miRNA zostanie obliczona czułość i swoistość oraz ich skuteczność diagnostyczna. Dla wszystkich analiz dwustronna wartość P wynosząca 0,05 lub mniej będzie uważana za statystycznie istotną.

5. Plan/rama czasu badań Plan czasowy K/rok Działania Q1 Przygotowanie oficjalnych dokumentów dotyczących pobierania próbek, gromadzenia danych i zatwierdzenia etycznego oraz obliczanie wielkości próby dla kontroli i pacjentów Q2 Pobieranie próbek od pacjentów według wybranych kryteriów i rozdzielanie surowicy na porcje Q3 Kontynuowanie pobierania próbek i oddzielanie surowica w porcjach + Ekstrakcja RNA z próbek Q4 Pobranie próbek kontrolnych i Ekstrakcja RNA Q1 Synteza cDNA dla wszystkich próbek + qPCR Q2 Analiza statystyczna danych i rozpoczęcie pisania pracy + Zbiór powiązanych artykułów do pisania pracy dyplomowej Q3 Publikacja pracy i sfinalizowaniu pracy dyplomowej do rewizji

II. Tytuł artykułu: „Przydatność diagnostyczna supresora nowotworu lub małych onkogennych biomarkerów w powiązaniu z LncRNA w raku piersi”

Autorski:

Marwa M. Mohamed, dr Eman Fouad Sanad, dr Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Autor zgłaszający do korespondencji: prof. Nadia M. Hamdy Pierwszy autor: Marwa M. Mohamed Autor(zy) współautor: dr Eman Fouad Sanad, dr Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Lista referencji:

1. DA Ragab, M. Sharkas, S. Marshall i J. Reen, „Wykrywanie raka piersi przy użyciu głębokich splotowych sieci neuronowych i maszyn wektorów nośnych”, PeerJ, tom. 7, s. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr i J. A. Margenthaler, „Molecular profiling of Breast Cancer”, „Surgical Oncology Clinics of North America, tom. 23, nie. 3. str. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar, „Treatment of metastatic Breast Cancer Network”, w JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, tom. 12, nie. 5 DODATEK, s. 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith i DC Tomlinson, „Rak piersi oporny na wiele leków: aktualne perspektywy”, „Rak piersi: cele i terapia, tom. 6, nie. 0. pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal i wsp., „Krajobraz mutacji somatycznych w 560 sekwencjach całego genomu raka piersi”, „Nature, tom. 534, nie. 7605, s. 47-54, 2016.
6. M. T. Maurano i in., „Systematyczna lokalizacja typowej zmienności związanej z chorobą w DNA regulatorowym”, Science (80-.), tom. 337, nie. 6099, s. 1190-1195, 2012.
7. M. V. Iorio i C. M. Croce, „Rozregulowanie mikroRNA w raku: diagnostyka, monitorowanie i terapia”. Obszerna recenzja, „EMBO Molecular Medicine, tom. 4, nie. 3. str. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi i D. P. Bartel, „Wpływ mikroRNA na produkcję białek”, „Nature, tom. 7209, s. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim i in., „Analiza mikromacierzy pokazuje, że niektóre mikroRNA regulują w dół dużą liczbę docelowych mRNA”, „Nature, tom. 433, nie. 7027, s. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya i N. Sonenberg, „Mechanizmy regulacji potranskrypcyjnej przez mikroRNA: czy odpowiedzi są w zasięgu wzroku?” Nature Recenzje Genetyka, tom. 9, nie. 2. str. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller i H. A. Coller, „Poszukiwanie konserwatywnych sekwencji w regionach kodujących ujawnia, że ​​mikroRNA let-7 celuje w Dicer w obrębie jego sekwencji kodującej”, „Proc. Natl. Acad. Sci., tom. 105, nie. 39, s. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong i JA Steitz, „Przejście od represji do aktywacji: mikroRNA mogą regulować translację w górę”, „Science (80-.)., tom. 318, nie. 5858, s. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek i A. T. Remaley, „MikroRNA są transportowane w osoczu i dostarczane do komórek biorców przez lipoproteiny o dużej gęstości”, „Nat. Cell Biol., tom. 13, nie. 4, s. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee i J. O. Lotvall, „Transfer mRNA i mikroRNA za pośrednictwem egzosomów to nowy mechanizm wymiany genatycznej między komórkami.”, „Nat. Cell Biol., tom. 9, nie. 6, s. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg i wsp., „Funkcjonalne dostarczanie wirusowych miRNA przez egzosomy”, „Proc. Natl. Acad. Sci., tom. 107, nie. 14, s. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz i B. Burwinkel, „Pozakomórkowe miRNA: tajemnica ich pochodzenia i funkcji”, „Trends Biochem. Sci., tom. 37, nie. 11, s. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin i F. J. Slack, „Serum prawdy na raka ---- mikroRNA mają ogromny potencjał jako biomarkery raka”, „Cell Res., tom. 18, nie. 10, s. 983-984, 2008.
18. Lu i wsp., „Journal of Experimental & Clinical Cancer Research” (2018)
19. Cui, L. i in. Ekspresja MicroRNA-301a i jego funkcjonalna rola w czerniaku złośliwym. Cellular fizjologia i biochemia: międzynarodowe czasopismo eksperymentalnej fizjologii komórkowej, biochemii i farmakologii 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. i Wang, S. Z. Zwiększona ekspresja mikroRNA-301a w niedrobnokomórkowym raku płuc i jej znaczenie kliniczne. Journal of raka badań i terapii 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. i in. miR-301a promuje proliferację komórek raka trzustki poprzez bezpośrednie hamowanie ekspresji Bim. Journal of cell biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. i in. Modulacja nowotworzenia przez prozapalny mikroRNA miR-301a w mysich modelach raka płuc i raka jelita grubego. Odkrycie komórek 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski i H. Y. Chang, „Długie niekodujące RNA i choroby ludzkie”, Trends in Cell Biology, tom. 21, nr 6. s. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov i I. Berindan-Neagoe, „Ukierunkowanie ncRNA przez roślinne metabolity wtórne: gra ncRNA w równowadze w kierunku hamowania nowotworów”, „Biotechnology postępu, tom. 36, nie. 6. str. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo i R. Johnson, „Długie niekodujące rnas: nowa (p) warstwa w„ ciemnej materii ”, „Frontiers in Genetics, tom. 2, nie. styczeń 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 oddziałuje z miR-765 i moduluje postęp raka płaskonabłonkowego języka poprzez celowanie w LAMC2. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 działa jako konkurencyjny endogenny RNA regulujący ekspresję VEGFA poprzez gąbkowanie hsa-miR-29b-3p w gruczolakoraku przewodowym trzustki. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim i wsp., „Korelacja wyników badań ultrasonograficznych z histologią, stopniem nowotworu i markerami biologicznymi w raku piersi”, „ActaOncol. (Madar)., tom. 47, nie. 8, s. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig i G. Campbell, „Wykresy charakterystyki działania odbiornika (ROC): podstawowe narzędzie oceny w medycynie klinicznej”, „Clinical Chemistry, tom. 39, nie. 4. str. 561-577, 1993.

(30)Hu, Z. B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang i H. B. Shen (2012) Profilowanie mikroRNA surowicy i piersi ryzyko raka: zastosowanie miR-484/191 jako kontroli endogennej. Rakotwórczość, 33, 828-834.