Eixo LINC00511/miR-185-3p e marcadores miR-301a-3p para diagnóstico de câncer de mama

1. Introdução 1.1. Antecedentes: O câncer de mama é uma das principais causas de morte de mulheres em todo o mundo, de acordo com a organização mundial da saúde (OMS), o número de casos de câncer esperados em 2025 será de 19,3 milhões de casos. No Egito, o câncer é um problema crescente e especialmente o câncer de mama [1].

   O câncer de mama é o tumor maligno feminino mais comum e uma grande ameaça à saúde das mulheres e seu desenvolvimento é uma invasão local consideravelmente agressiva, metástases precoces e resistência a múltiplas drogas à quimioterapia [2, 3]. Portanto, o desenvolvimento de marcadores minimamente invasivos para detecção precoce do câncer de mama é de grande interesse.

   O Atlas do genoma do câncer (TCGA) revelou que muitas das mutações e alterações no número de cópias encontradas no câncer não se sobrepõem aos genes codificadores de proteínas [4], mas estão frequentemente localizadas em DNA não codificante, incluindo genes de RNA não codificantes [5] . Os microRNAs (miRNAs) estavam entre os primeiros RNAs não codificantes a serem investigados no câncer e seus papéis como alvos terapêuticos ou biomarcadores no câncer [6].

   MiRNAs são sequências curtas de RNA de fita simples (geralmente 19-23 nucleotídeos) que controlam a expressão gênica em uma variedade de processos fisiológicos e de desenvolvimento, tendo assim um papel crítico na regulação pós-transcricional da expressão gênica em uma ampla gama de sistemas biológicos [7, 8]. Os miRNAs medeiam a repressão do mRNA alvo pelo emparelhamento de bases com a sequência complementar na 3'-UTR, causando desestabilização do transcrito, repressão translacional ou ambos [9]. Foi relatado que os miRNAs também modulam a expressão gênica ligando-se a outras regiões, incluindo éxons codificadores de proteínas [10], e podem até induzir a expressão gênica em células de mamíferos [11].

   Os miRNAs circulantes livres de células geralmente existem ligados a complexos de ribonucleoproteínas ou lipoproteínas de alta densidade ou são liberados das células em vesículas lipídicas, microvesículas, exossomos ou corpos apoptóticos [12-15]. Assim, os miRNAs circulantes podem refletir a resposta homeostática do organismo, bem como sinais de progressão da doença. Devido à sua estabilidade e resistência à atividade endógena da RNAse, esses miRNAs foram propostos como biomarcadores diagnósticos e prognósticos para doenças, incluindo o câncer [16].

   Entre esses miRNAs, o MiR-185-3p foi identificado como um gene supressor de tumor em vários tipos de câncer. A expressão de miR-185-3p foi diminuída nas células de câncer de mama MDA-MB-231 e MCF-7. Além disso, o miR-185-3p foi superexpresso na transfecção silenciada LINC00511, enquanto diminuiu na transfecção aprimorada do plasmídeo LINC00511 [17].

   MicroRNA-301a é outro oncomiR que tem sido relacionado à progressão tumoral em diversos tipos de câncer. Por exemplo, no câncer de próstata, câncer gástrico e também no câncer de pâncreas [18-21]. No entanto, seu papel no câncer de mama não está totalmente investigado.

   RNAs não codificantes longos (LncRNAs) são aqueles com mais de 200 nucleotídeos, e muitos deles também podem atuar como transcritos primários para produzir RNAs curtos. Geralmente, os LncRNAs têm sido implicados em funções reguladoras de genes, como compensação de dosagem de cromatina, impressão, regulação epigenética, controle do ciclo celular, tráfego nuclear e citoplasmático e diferenciação celular (22). Além disso, a interação pré-mRNA onde o transcrito primário está interagindo com LncRNAs e termina com uma sequência de splicing funcional diferente ou é degradada em pequenos RNAs interferentes endógenos, esponjas de miRNA, modulação da atividade proteica ou localização e facilitação da formação de complexos riboproteicos. Não menos importante, os LncRNAs podem ser precursores de fragmentos menores, como miRNAs ou piRNAs. A principal função dos ciRNAs consiste na captura de miRNAs através de interações complementares, funcionando como esponjas de miRNAs [23]. Os LncRNAs já foram implicados em doenças humanas, incluindo câncer [24].

   RNA não codificante intergênico longo 00511 (LINC00511); é um oncogene que influencia o tamanho do tumor, metástase e mau prognóstico. LINC00511 liga a histona metiltransferase EZH2 e especifica o padrão de modificação de histonas em p57 [25]. Também atua como um oncogene no carcinoma espinocelular e no adenocarcinoma ductal pancreático [26]. Em particular, pouco se sabe se os LncRNAs podem servir como biomarcadores para o prognóstico ou diagnóstico do câncer. [27] 1.2. Problema: O papel desses biomarcadores ainda não foi investigado no diagnóstico precoce do câncer de mama.

   1.3. Hipótese: Supressor de Tumor ou Biomarcadores Oncogênicos e LncRNA usados ​​no diagnóstico precoce do câncer de mama"

2. Objetivo do Trabalho:

   O objetivo final do trabalho é fornecer uma imagem mais clara das funções do miR-185-3p, miR-301a, em associação com LINC00511 no diagnóstico precoce de tumores de mama com medição de sensibilidade e especificidade.

3. Resultados de estudos anteriores: em meia página. Nenhum estudo clínico anterior foi feito sobre o aspecto das utilidades diagnósticas dos biomarcadores estudados.

4. Declaração do problema:

   O papel desses biomarcadores ainda não foi investigado no diagnóstico precoce do câncer de mama em pacientes egípcios.

5. Significância da pesquisa:

Resultado primário:

• Identificar câncer de mama supressor de tumor circulante no sangue periférico ou pequenos biomarcadores oncogênicos e comparar com a expressão de controle normal

Resultado Secundário:

• Para calcular a sensibilidade e a especificidade do miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 em comparação com os marcadores baseados em proteínas (CEA e CA15-3) como marcadores de diagnóstico.

6. Objectivos da Investigação:

1. Analise o nível de expressão de dois miRNA (miR-185-3p, miR-301a) e seu lncRNA interagido previsto (LINC00511) como marcadores moleculares não invasivos mínimos para diagnosticar o câncer de mama primário.
2. Compare miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 com os marcadores baseados em proteínas (CEA e CA15-3) como marcadores de diagnóstico, em relação à sensibilidade e especificidade.
3. Estudar a relação entre miR-185-3p, miR-301a e LINC00511 e os caracteres clinicopatológicos do câncer de mama.
4. Metodologia de Pesquisa:

Este estudo será primeiro aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams e pelo Comitê de Ética do Instituto Nacional do Câncer, New Cairo. Além disso, será realizado de acordo com as Diretrizes da Declaração de Helsinque, onde dois grupos serão incluídos e todos os sujeitos darão seu consentimento por escrito, para ser arquivado.

Grupo 1, o grupo de controle: um total de 50 voluntários saudáveis, mulheres saudáveis ​​de mesma idade, voluntárias que não sofrem de nenhuma doença ou tomam qualquer medicamento.

Grupo 2 (Tumor maligno de mama): 50 mulheres com câncer de mama primário não metastático Pacientes recentemente diagnosticados que ainda não receberam quimioterapia ou radioterapia, frequentando o Instituto Nacional do Câncer, Novo Cairo.

O histórico completo será obtido para todos os casos e controles. As características das pacientes com câncer de mama em relação à idade, estado da menopausa, tipo histopatológico, tamanho do tumor, metástase linfonodal e grau do tumor, bem como receptor de estrogênio (ER) e receptor de progesterona (PR) serão coletados para análise de dados.

Critério de exclusão

Pacientes com:

• Doenças sanguíneas, -Qualquer câncer que não seja câncer de mama
• Cirrose hepática, doenças da bexiga uterina e urinária

Métodos:

Trabalho de rotina:

Amostra de sangue:

5 ml de sangue serão coletados em tubos vaccutainer simples para preparação de soro. As amostras de soro serão armazenadas a -80 ºC até a avaliação bioquímica no Laboratório de Pesquisa do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams.

Ensaio de miR-185-3p, miR-301a e LINC00511por PCR Quantitativo:

MiRNA e LncRNAs serão extraídos do soro usando Qiagen miRNeasy Mini Kit de acordo com o protocolo do fabricante e suas concentrações e purezas serão detectadas por espectrofotômetro nanodrop.

O RNA enriquecido será transcrito reversamente com kit de transcrição reversa miroRNA ou LncRNAs de acordo com o protocolo do fabricante.

A expressão de miRNA e LncRNAs será quantificada por qRT-PCR utilizando kits de ensaio de MicroRNA e LncRNAs humanos e seus primers específicos.

Os níveis de expressão do miRNA investigado serão avaliados pelo método ∆Ct [28]. O valor do limite do ciclo (Ct) é o número de ciclos qPCR necessários para que o sinal fluorescente cruze um limite específico. ∆Ct será calculado subtraindo os valores de Ct de RNU6-2 e GAPDH daqueles dos miRNAs e LncRNAs investigados, respectivamente. O ∆∆Ct será calculado subtraindo o ∆Ct das amostras de controle do ∆Ct das amostras de câncer.

Exame de receptores hormonais e marcadores tumorais baseados em proteínas: Tanto o receptor de estrogênio, o receptor de progesterona e o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER-2neu), além dos marcadores tumorais CEA e CA15.3 usando kits ELISA serão obtidos do National Cancer Institute , Novo Cairo.

ESTIMATIVA DO TAMANHO DA AMOSTRA O objetivo deste estudo é investigar o papel de alguns MiRNAs circulantes de controle independente e casos de câncer de mama com 1 controle por sujeito experimental. Com base em estudo anterior (Hu et al. 2012) a expressão de pequenos biomarcadores oncogênicos foi normalmente distribuída com desvio padrão de 2,9 e tamanho de efeito grande (1,09). Se as verdadeiras diferenças nas médias do grupo de câncer de mama e do grupo de controle forem 2,25, precisaremos estudar 25 sujeitos experimentais e 25 sujeitos de controle para podermos rejeitar a hipótese nula de que as médias populacionais dos grupos experimentais e de controle são iguais em probabilidade ( potência) 0,8. A probabilidade de erro Tipo I associada a este teste desta hipótese nula é 0,05.

No que diz respeito ao supressor tumoral, as médias de expressão foram normalmente distribuídas com grande tamanho de efeito (1,4). Se as verdadeiras diferenças nas médias do grupo de câncer de mama e do grupo de controle forem 14, precisaremos estudar 15 sujeitos experimentais e 15 sujeitos de controle para podermos rejeitar a hipótese nula de que as médias populacionais dos grupos experimentais e de controle são iguais em probabilidade ( potência) 0,8. A probabilidade de erro Tipo I associada a este teste desta hipótese nula é 0,05.

O tamanho total da amostra será de 80 casos, esse número será aumentado em 25% para perdas esperadas, e a amostra total será de 100 sujeitos, 50 sujeitos por grupo.

A estimativa do tamanho da amostra foi realizada pela calculadora de tamanho de amostra G power*.

Análise Estatística:

O pacote de software SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL) será utilizado para realizar as análises estatísticas. O teste T ou teste U de Mann-Whitney será usado para comparar a diferença de variáveis ​​​​contínuas em dois grupos, conforme apropriado. A análise do qui-quadrado de Pearson ou o teste exato de Fisher serão empregados para comparar a diferença das variáveis ​​​​categóricas. A curva característica de operação do receptor (ROC) e a área sob a curva ROC (AUC) serão traçadas para determinar o melhor ponto de corte que discrimina entre grupos com câncer e sem câncer; as sensibilidades e especificidades serão calculadas para os miRNAs e sua eficácia diagnóstica. Para todas as análises, um valor P bicaudal de 0,05 ou menos será considerado estatisticamente significativo.

5. Plano/Quadro de Tempo de Pesquisa i. Plano de tempo Q/ano Ações Q1 Preparação de documentos oficiais para coleta de amostras, coleta de dados e aprovação ética e cálculo do tamanho da amostra para controle e pacientes Q2 Coleta de amostras de pacientes com critérios selecionados e separação de soro em alíquotas Q3 Continuar coletas de amostras e separação de soro em alíquotas + Extração de RNA das amostras Q4 Coleta de amostras de controle e Extração de RNA Q1 Síntese de cDNA para todas as amostras + qPCR Q2 Análise estatística dos dados e início da redação de um artigo + coleta de artigos relacionados para redação de teses Q3 Publicação de o artigo e finalizando a tese para revisão

ii. Título do artigo: "A utilidade diagnóstica do supressor de tumor ou pequenos biomarcadores oncogênicos em associação com LncRNA no câncer de mama"

Autores:

Marwa M. Mohamed, Dr.

Autor responsável pelo envio: Prof. Nadia M. Hamdy Primeiro autor: Marwa M. Mohamed Autor(es) contribuinte(s): Dr.

6. Lista de Referências:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall e J. Reen, "Detecção de câncer de mama usando redes neurais convolucionais profundas e máquinas de vetores de suporte", PeerJ, vol. 7, pág. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr e J. A. Margenthaler, "Perfil molecular do câncer de mama", Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 23, não. 3. Pp. 451-462, 2014.
3. WJ Gradishar, "Tratamento do câncer de mama metastático", no JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, vol. 12, não. 5 SUP., pp., 759-761.
4. HL Martin, L. Smith e DC Tomlinson, "Câncer de mama multirresistente: Perspectivas atuais", Câncer de mama: alvos e terapia, vol. 6, não. 0. pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal et al., "Paisagem de mutações somáticas em 560 sequências do genoma completo do câncer de mama", Nature, vol. 534, não. 7605, pág. 47-54, 2016.
6. MT Maurano et al., "Localização sistemática da variação comum associada à doença no DNA regulador", Science (80-.)., vol. 337, não. 6099, pág. 1190-1195, 2012.
7. MV Iorio e CM Croce, "Desregulação de MicroRNA no câncer: Diagnóstico, monitoramento e terapêutica. Uma revisão abrangente, "EMBO Molecular Medicine, vol. 4, não. 3. Pp. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, FD Camargo, SP Gygi e DP Bartel, "O impacto dos microRNAs na produção de proteínas", Nature, vol. 7209, pág. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim et al., "A análise de microarray mostra que alguns microRNAs regulam negativamente um grande número de mRNAs alvo", Nature, vol. 433, não. 7027, pág. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, SN Bhattacharyya e N. Sonenberg, "Mecanismos de regulação pós-transcricional por microRNAs: as respostas estão à vista?" Nature Reviews Genética, vol. 9, não. 2. pp. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller e H. A. Coller,"Uma pesquisa por sequências conservadas em regiões de codificação revela que o microRNA let-7 tem como alvo Dicer dentro de sua sequência de codificação," Proc. Nacional. Acad. Ciência, vol. 105, não. 39, pp. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong e J. A. Steitz, "Mudando da repressão para a ativação: MicroRNAs podem regular positivamente a tradução", Science (80-.)., vol. 318, não. 5858, pág. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, BT Palmisano, BM Shoucri, RD Shamburek e A. T. Remaley, "MicroRNAs são transportados no plasma e entregues às células receptoras por lipoproteínas de alta densidade", Nat. Cell Biol., vol. 13, não. 4, pp. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee e JO Lotvall, "A transferência de mRNA e microRNAs mediada por exossomo é um novo mecanismo de troca genética entre células., "Nat. Cell Biol., vol. 9, não. 6, pp. 654-9, 2007.
15. JL Lindenberg et al., "Funcional delivery of viral miRNAs via exosomes", Proc. Nacional. Acad. Ciência, vol. 107, não. 14, pp. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz e B. Burwinkel, "MiRNAs extracelulares: O mistério de sua origem e função", Trends Biochem. Ciência, vol. 37, não. 11, pp. 460-465, 2012.
17. LJ Chin e FJ Slack, "Um soro da verdade para o câncer ---- microRNAs têm grande potencial como biomarcadores de câncer", Cell Res., vol. 18, não. 10, pp. 983-984, 2008.
18. Lu et al, "Jornal de Pesquisa Experimental e Clínica do Câncer" (2018)
19. Cui, L. et al. Expressão do MicroRNA-301a e suas funções funcionais no melanoma maligno. Fisiologia celular e bioquímica: jornal internacional de fisiologia celular experimental, bioquímica e farmacologia 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. Aumento da expressão de microRNA-301a em câncer de pulmão de células não pequenas e seu significado clínico. Jornal de pesquisa e terapêutica do câncer 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et al. O miR-301a promove a proliferação de células cancerígenas pancreáticas ao inibir diretamente a expressão de Bim. Jornal de bioquímica celular 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et al. Modulação da tumorigênese pelo microRNA pró-inflamatório miR-301a em modelos de camundongos com câncer de pulmão e câncer colorretal. Descoberta celular 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski e HY Chang, "RNAs não codificantes longos e doenças humanas", Trends in Cell Biology, vol. 21, nº 6. pp. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov e I. Berindan-Neagoe, "Direcionando ncRNAs por metabólitos secundários de plantas: O jogo de ncRNAs em equilíbrio para a inibição de malignidades", Biotechnology advances, vol. 36, não. 6. Pág. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo e R. Johnson, "Os longos rnas não codificantes: Uma nova (p) camada na 'matéria escura", Frontiers in Genetics, vol. 2, não. Janeiro de 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 interage com o miR-765 e modula a progressão do carcinoma espinocelular da língua, visando o LAMC2. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 atua como um RNA endógeno concorrente para regular a expressão de VEGFA através da esponja hsa-miR-29b-3p no adenocarcinoma ductal pancreático. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. SH Kim et al., "Correlação de resultados de ultrassom com histologia, grau de tumor e marcadores biológicos em câncer de mama", ActaOncol. (Madar)., vol. 47, não. 8, pp. 1531-1538, 2008.
29. MH Zweig e G. Campbell, "Gráficos de características de operação do receptor (ROC): Uma ferramenta de avaliação fundamental em medicina clínica", Clinical Chemistry, vol. 39, não. 4. Pp. 561-577, 1993.

(30) Hu, Z. B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) Perfil de microRNA sérico e mama risco de câncer: o uso de miR-484/191 como controles endógenos. Carcinogênese, 33, 828-834.