LINC00511/miR-185-3p Axis och miR-301a-3p Markörer för diagnos av bröstcancer

1. Inledning 1.1. Bakgrund: Bröstcancer är en av de vanligaste dödsorsakerna för kvinnor globalt, enligt världshälsoorganisationen (WHO) kommer antalet cancerfall som förväntas år 2025 att vara 19,3 miljoner fall. I Egypten är cancer ett ökande problem och särskilt bröstcancer [1].

   Bröstcancer är den vanligaste kvinnliga maligna tumören och ett stort hot mot kvinnors hälsa och dess utveckling är avsevärt aggressiv lokal invasion, tidiga metastaser och multiläkemedelsresistens mot kemoterapi [2, 3]. Därför är utvecklingen av minimalt invasiva markörer för tidig upptäckt av bröstcancer av stort intresse.

   Cancergenomet Atlas (TCGA) avslöjade att många av mutationerna och kopieantalförändringarna som finns i cancer inte överlappar med proteinkodande gener [4], utan är ofta lokaliserade i icke-kodande DNA-inklusive icke-kodande RNA-gener [5] . MikroRNA (miRNA) var bland de första icke-kodande RNA:er som undersöktes cancer, och deras roller som terapeutiska mål eller biomarkörer i cancer [6].

   MiRNA är korta, enkelsträngade RNA-sekvenser (vanligtvis 19-23 nukleotider) som kontrollerar genuttryck i en mängd olika fysiologiska och utvecklingsmässiga processer, och har således en avgörande roll i posttranskriptionell reglering av genuttryck i ett brett spektrum av biologiska system [7, 8]. MiRNA medierar undertryckandet av mål-mRNA genom basparning med komplementär sekvens i 3'-UTR, vilket orsakar transkriptdestabilisering, translationell repression eller båda [9]. Det har rapporterats att miRNA också modulerar genuttryck genom att binda till andra regioner, inklusive proteinkodande exoner [10], och kan till och med inducera genuttryck i däggdjursceller [11].

   Cellfria cirkulerande miRNA finns vanligtvis bundna till ribonukleoproteinkomplex eller högdensitetslipoprotein eller så frigörs de från celler i lipidvesiklar, mikrovesiklar, exosomer eller apoptotiska kroppar [12-15]. Cirkulerande miRNA kan således återspegla homeostatisk respons från organism, såväl som tecken på sjukdomsprogression. På grund av deras stabilitet och resistens mot endogen RNAse-aktivitet har dessa miRNA föreslagits som diagnostiska och prognostiska biomarkörer för sjukdomar, inklusive cancer [16].

   Bland dessa miRNA har MiR-185-3p identifierats som en tumörsuppressorgen i olika typer av cancer. Uttrycket av miR-185-3p minskade i bröstcancerceller MDA-MB-231 och MCF-7. Dessutom var miR-185-3p överuttryckt i LINC00511 tystad transfektion, medan den minskade i den förstärkta LINC00511 plasmidtransfektionen [17].

   MicroRNA-301a är en annan oncomiR som har relaterats till tumörprogression i flera typer av cancer. Till exempel vid prostatacancer, magcancer samt pankreascancer [18-21]. Dess roll vid bröstcancer är dock inte helt undersökt.

   Långa icke-kodande RNA (LncRNA) är de som är längre än 200 nukleotider, och många av dem kan också fungera som primära transkript för att producera korta RNA. Generellt sett har LncRNA varit inblandade i genreglerande roller, såsom kromatindoskompensation, prägling, epigenetisk reglering, cellcykelkontroll, nukleär och cytoplasmatisk trafficking och celldifferentiering [22]. Dessutom pre-mRNA-interaktion där det primära transkriptet interagerar med LncRNA och slutar med en annan funktionell splitsad sekvens eller bryts ned till endogena små interfererande RNA, miRNA-svampar, modulering av proteinaktivitet eller lokalisering och underlättande av riboproteinkomplexbildning. Inte det minsta kan LncRNA stå som prekursorer för mindre fragment som miRNA eller piRNA. Huvudfunktionen hos ciRNA består i att miRNA fångar genom komplementära interaktioner, fungerar som miRNA-svamp [23]. LncRNA har redan varit inblandade i mänskliga sjukdomar inklusive cancer [24].

   Långt intergeniskt icke-kodande RNA 00511 (LINC00511); är en onkogen som påverkar tumörstorlek, metastasering och dålig prognos. LINC00511 binder histonmetyltransferas EZH2 och specificerar histonmodifieringsmönstret på p57 [25]. Det fungerar också som en onkogen i skivepitelcancer och pankreatisk duktal adenokarcinom [26]. I synnerhet är lite känt om LncRNA kan fungera som biomarkörer för cancerprognos eller diagnos. [27] 1.2. Problem: Dessa biomarkörers roll har ännu inte undersökts vid tidig diagnos av bröstcancer.

   1.3. Hypotes: Tumörsuppressor eller onkogena biomarkörer och LncRNA som används vid tidig diagnos av bröstcancer"

2. Målet med arbetet:

   Det yttersta syftet med arbetet är att ge en tydligare bild av funktionerna hos miR-185-3p, miR-301a, i samband med LINC00511 vid tidig diagnos av brösttumörer med mätning av både sensitivitet och specificitet.

3. Tidigare studier Resultat: på halv sida. Inga tidigare kliniska studier har gjorts på aspekten av de diagnostiska användbarheterna av de studerade biomarkörerna.

4. Problembeskrivning:

   Rollen för dessa biomarkörer har ännu inte undersökts vid tidig diagnos av bröstcancer hos egyptiska patienter.

5. Forskningens betydelse:

Primärt resultat:

• För att identifiera perifer blodcirkulerande tumörsuppressor eller onkogena små biomarkörer bröstcancer och att jämföra med normalt kontrolluttryck

Sekundärt resultat:

• Att beräkna sensitivitet och specificitet för miR-185-3p, miR-301a och LINC00511 jämfört med de proteinbaserade markörerna (CEA och CA15-3) som diagnostiska markörer.

6. Forskningsmål:

1. Analysera uttrycksnivån för två miRNA (miR-185-3p, miR-301a) och deras förutsagda interagerade lncRNA (LINC00511) som minimala icke-invasiva molekylära markörer för att diagnostisera den primära bröstcancern.
2. Jämför miR-185-3p, miR-301a och LINC00511 med de proteinbaserade markörerna (CEA och CA15-3) som diagnostiska markörer när det gäller sensitivitet och specificitet.
3. Studera sambandet mellan miR-185-3p, miR-301a och LINC00511 och de klinisk-patologiska karaktärerna av bröstcancer.
4. Forskningsmetodik:

Denna studie kommer först att godkännas av den etiska kommittén för farmaceutiska fakulteten, Ain Shams University och av den etiska kommittén för National Cancer Institute, New Cairo. Dessutom kommer det att utföras i enlighet med Helsingforsdeklarationens riktlinjer, där två grupper kommer att inkluderas och alla försökspersoner kommer att ge sitt skriftliga medgivande att arkiveras.

Grupp 1 kontrollgruppen: Totalt 50 friska frivilliga som är åldersmatchade friska kvinnliga frivilliga som inte lider av någon sjukdom eller tar någon medicin.

Grupp 2 (maligna brösttumörer): 50 kvinnor med icke-metastaserande primär bröstcancer Patienter som nyligen fått diagnosen och som ännu inte har fått någon kemoterapi eller strålbehandling, går på National Cancer Institute, New Cairo.

Fullständig historik kommer att tas för alla fall och kontroll. Bröstcancerpatienternas egenskaper med avseende på ålder, menopausal status, histopatologisk typ, tumörstorlek, lymfkörtelmetastaser och tumörgrad, samt östrogenreceptor (ER) och progesteronreceptor (PR) kommer att samlas in för dataanalys.

Exklusions kriterier

Patienter med:

• Blodsjukdomar, -All cancer förutom bröstcancer
• Levercirros, livmoder och urinblåsa sjukdomar

Metoder:

Rutinarbete:

Blodprov:

5 ml blod kommer att samlas upp i vanliga vaccutainerrör för serumberedning. Serumprover kommer att förvaras vid -80 ºC fram till biokemisk bedömning vid Biochemistry Department Research Lab, Farmaceutiska fakulteten, Ain Shams University.

Analys av miR-185-3p, miR-301a och LINC00511 genom kvantitativ PCR:

MiRNA och LncRNA kommer att extraheras från serum med Qiagen miRNeasy Mini Kit enligt tillverkarens protokoll och deras koncentration och renhet kommer att detekteras med nanodropspektrofotometer.

Anrikat RNA kommer att omvänt transkriberas med miroRNA eller LncRNAs omvänd transkriptionskit enligt tillverkarens protokoll.

Uttryck av miRNA och LncRNA kommer att kvantifieras med qRT-PCR med användning av humana MicroRNA och LncRNA analyssatser och deras specifika primers.

Expressionsnivåerna för det undersökta miRNA:t kommer att utvärderas med ∆Ct-metoden [28]. Cykeltröskelvärdet (Ct) är antalet qPCR-cykler som krävs för att den fluorescerande signalen ska passera ett specifikt tröskelvärde. ∆Ct kommer att beräknas genom att subtrahera Ct-värdena för RNU6-2 och GAPDH från de för undersökta miRNA respektive LncRNA. ∆∆Ct kommer att beräknas genom att subtrahera ∆Ct för kontrollproverna från ∆Ct för cancerproverna.

Undersökning av hormonreceptorer och proteinbaserade tumörmarkörer: Både östrogenreceptor, progesteronreceptor och human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER-2neu), förutom CEA- och CA15.3-tumörmarkörer med hjälp av ELISA-kit kommer att erhållas från National Cancer Institute , Nya Kairo.

UPPSKATTNING AV PROVSTORLEK Syftet med denna studie är att undersöka rollen för vissa cirkulerande MiRNA från oberoende kontroll- och bröstcancerfall med 1 kontroll per försöksperson. Baserat på tidigare studie (Hu et al. 2012) var uttrycket av onkogena små biomarkörer normalfördelat med standardavvikelse 2,9 och stor effektstorlek (1,09). Om de sanna skillnaderna i bröstcancergruppens och kontrollgruppens medelvärden är 2,25 kommer vi att behöva studera 25 försökspersoner och 25 kontrollpersoner för att kunna förkasta nollhypotesen att populationsmedelvärdena för försöks- och kontrollgruppen är lika med sannolikhet ( effekt) 0,8. Sannolikheten för typ I-fel associerad med detta test av denna nollhypotes är 0,05.

När det gäller tumörsuppressorn var uttrycksmedlet normalt fördelat med stor effektstorlek (1,4). Om de sanna skillnaderna i bröstcancergruppens och kontrollgruppens medelvärden är 14 kommer vi att behöva studera 15 försökspersoner och 15 kontrollpersoner för att kunna förkasta nollhypotesen att populationsmedelvärdena för försöks- och kontrollgruppen är lika med sannolikhet ( effekt) 0,8. Sannolikheten för typ I-fel associerad med detta test av denna nollhypotes är 0,05.

Den totala urvalsstorleken kommer att vara 80 fall, detta antal kommer att ökas med 25 % för förväntade förluster, och det totala urvalet är 100 försökspersoner, 50 försökspersoner per grupp.

Uppskattning av provstorleken utfördes med G power* provstorlekskalkylator.

Statistisk analys:

SPSS 21.0 mjukvarupaket (SPSS,Chicago,IL) kommer att användas för att utföra de statistiska analyserna. T-test eller Mann-Whitneys U-test kommer att användas för att jämföra skillnaden mellan kontinuerliga variabler i två grupper efter behov. Pearsons chi-kvadratanalys eller Fishers exakta test kommer att användas för att jämföra skillnaden mellan kategoriska variabler. Mottagarens funktionskarakteristik (ROC) kurva och area under ROC-kurvan (AUC) kommer att plottas för att bestämma den bästa cutoff-punkten som skiljer mellan cancer- och icke-cancergrupper; sensitiviteterna och specificiteterna kommer att beräknas för miRNA och deras diagnostiska effektivitet. För alla analyser kommer ett tvåsidigt P-värde på 0,05 eller mindre att betraktas som statistiskt signifikant.

5. Forskningstidsplan/ram i. Tidsplan Q/år Åtgärder Q1 Utarbetande av de officiella dokumenten för provinsamling, datainsamling och etiskt godkännande samt beräkna provstorlek för kontroll och patienter Q2 Provtagning från patienter med utvalda kriterier och separering av serum i alikvoter Q3 Fortsätta provtagningar och separering av serum i alikvoter + Extraktion av RNA från proverna Q4 Insamling av kontrollprover och Extraktion av RNA Q1 cDNA-syntes för alla prover + qPCR Q2 Statistisk analys av data och påbörjande av en uppsats + samling av relaterade artiklar för avhandlingsskrivning Q3 Publicering av uppsatsen och färdigställande av avhandlingen för revidering

ii. Artikeltitel: "Den diagnostiska nyttan av tumörsuppressor eller onkogena små biomarkörer i samband med LncRNA vid bröstcancer"

Författare:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Motsvarande inlämnande författare: Prof. Nadia M. Hamdy Första författare: Marwa M. Mohamed Bidragande författare(r): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Referenslista:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall och J. Reen," Bröstcancerdetektering med djupa konvolutionella neurala nätverk och stödvektormaskiner," PeerJ, vol. 7, sid. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr och J. A. Margenthaler," Molecular profiling of breast cancer, "Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 23, nr. 3. Sid. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar,"Behandling av metastaserad bröstcancer, "i JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, vol. 12, nr. 5 SUPPL., sid. 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith och D. C. Tomlinson, "Multidrug-resistant breast cancer: Current perspectives", "Breast Cancer: Targets and Therapy, vol. 6, nr. 0. pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal et al., "Landskap av somatiska mutationer i 560 helgenomsekvenser för bröstcancer", Nature, vol. 534, nr. 7605, sid. 47-54, 2016.
6. M.T. Maurano et al., "Systematisk lokalisering av vanlig sjukdomsassocierad variation i regulatoriskt DNA," Science (80-.), vol. 337, nr. 6099, sid. 1190-1195, 2012.
7. M.V. Iorio och C.M. Croce, "MicroRNA dysregulation in cancer: Diagnostics, monitoring and therapeutics. En omfattande recension, "EMBO Molecular Medicine, vol. 4, nr. 3. Sid. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi och D. P. Bartel, "The impact of microRNAs on protein output," Nature, vol. 7209, sid. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim et al., "Microarray-analys visar att vissa mikroRNA nedreglerar ett stort antal mål-mRNA", Nature, vol. 433, nr. 7027, sid. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya och N. Sonenberg, "Mekanismer för post-transkriptionell reglering av mikroRNA: Finns svaren i sikte?" Nature Reviews Genetics, vol. 9, nr. 2. pp. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller och H. A. Coller,"En sökning efter bevarade sekvenser i kodande regioner avslöjar att let-7 mikroRNA riktar sig mot Dicer inom dess kodande sekvens, "Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 105, nr. 39, sid. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong och J. A. Steitz, "Växla från förtryck till aktivering: MicroRNAs kan uppreglera översättning", "Science (80-.), vol. 318, nr. 5858, sid. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek och A. T. Remaley, "MikroRNA transporteras i plasma och levereras till mottagarceller av lipoproteiner med hög denisty", "Nat. Cell Biol., vol. 13, nr. 4, sid. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekström, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee och J. O. Lotvall, "Exosom-medierad överföring av mRNA och mikroRNA är en ny mekanism för genetiskt utbyte mellan celler.", "Nat. Cell Biol., vol. 9, nr. 6, sid. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg et al., "Funktionell leverans av virala miRNA via exosomer", Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 107, nr. 14, sid. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz och B. Burwinkel, "Extracellulära miRNA: Mysteriet med deras ursprung och funktion," Trender Biochem. Sci., vol. 37, nr. 11, sid. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin och F. J. Slack, "Ett sanningsserum för cancer ---- mikroRNA har stor potential som cancerbiomarkörer", "Cell Res., vol. 18, nr. 10, sid. 983-984, 2008.
18. Lu et al, "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research" (2018)
19. Cui, L. et al. Uttryck av MicroRNA-301a och dess funktionella roller i malignt melanom. Cellulär fysiologi och biokemi: internationell tidskrift för experimentell cellulär fysiologi, biokemi och farmakologi 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. Ökat uttryck av mikroRNA-301a i icke-småcellig lungcancer och dess kliniska betydelse. Journal of cancer research and therapeutics 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et al. miR-301a främjar proliferation av pankreascancerceller genom att direkt hämma Bim-uttryck. Journal of cellular biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et al. Modulering av tumörbildning av det pro-inflammatoriska mikroRNA miR-301a i musmodeller av lungcancer och kolorektal cancer. Cell discovery 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski och H. Y. Chang, "Long noncoding RNAs and human disease," Trends in Cell Biology, vol. 21, nr 6. pp. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov och I. Berindan-Neagoe, "Targeting ncRNAs by plant secondary metabolites: The ncRNAs game in balance to malignancy inhibition", "Biotechnology advances, vol. 36, nr. 6. pp. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo och R. Johnson, "The long non-coding rnas: A new (p)layer in the dark matter," Frontiers in Genetics, vol. 2, nr. januari 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 interagerar med miR-765 och modulerar utvecklingen av skivepitelcancer i tungan genom att rikta in sig på LAMC2. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 fungerar som ett konkurrerande endogent RNA för att reglera VEGFA-uttryck genom svampning av hsa-miR-29b-3p i pankreas duktalt adenokarcinom. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim et al., "Korrelation mellan ultraljudsresultat med histologi, tumörgrad och biologiska markörer vid bröstcancer," ActaOncol. (Madar), vol. 47, nr. 8, sid. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig och G. Campbell, "Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine", "Clinical Chemistry, vol. 39, nr. 4. Sid. 561-577, 1993.

(30)Hu, Z.B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) SerummikroRNA-profilering och bröst cancerrisk: användningen av miR-484/191 som endogena kontroller. Carcinogenesis, 33, 828-834.