Markery LINC00511/miR-185-3p osy a miR-301a-3p pro diagnostiku rakoviny prsu

1. Úvod 1.1. Pozadí: Rakovina prsu je jednou z hlavních příčin úmrtí žen na celém světě, podle Světové zdravotnické organizace (WHO) bude počet případů rakoviny očekávaný v roce 2025 činit 19,3 milionu případů. V Egyptě je rakovina stále větším problémem a zejména rakovina prsu [1].

   Karcinom prsu je nejčastějším ženským zhoubným nádorem a velkou hrozbou pro zdraví žen a jeho rozvojem je značně agresivní lokální invaze, časné metastázy a multirezistence vůči chemoterapii [2, 3]. Proto je vývoj minimálně invazivních markerů pro včasnou detekci rakoviny prsu velmi zajímavý.

   Atlas rakovinového genomu (TCGA) odhalil, že mnohé z mutací a změn počtu kopií nalezených u rakoviny se nepřekrývají s geny kódujícími protein [4], ale jsou často umístěny v nekódujících genech DNA včetně nekódujících RNA [5]. . MikroRNA (miRNA) byly mezi prvními nekódujícími RNA, které byly zkoumány u rakoviny a jejich role jako terapeutických cílů nebo biomarkerů u rakoviny [6].

   MiRNA jsou krátké, jednovláknové RNA sekvence (obvykle 19-23 nukleotidů), které řídí genovou expresi v různých fyziologických a vývojových procesech, a tak mají kritickou roli v posttranskripční regulaci genové exprese v široké škále biologických systémů [7, 8]. MiRNA zprostředkovávají represi cílové mRNA párováním bází s komplementární sekvencí v 3'-UTR, což způsobuje destabilizaci transkriptu, translační represi nebo obojí [9]. Bylo publikováno, že miRNA také modulují genovou expresi vazbou na jiné oblasti, včetně exonů kódujících protein [10], a mohou dokonce indukovat genovou expresi v savčích buňkách [11].

   Bezbuněčné cirkulující miRNA obvykle existují vázané na ribonukleoproteinové komplexy nebo lipoprotein s vysokou hustotou nebo jsou uvolňovány z buněk v lipidových vezikulách, mikrovezikulech, exozomech nebo apoptotických tělech [12-15]. Cirkulující miRNA tak mohou odrážet homeostatickou odpověď organismu, stejně jako známky progrese onemocnění. Vzhledem ke své stabilitě a odolnosti vůči aktivitě endogenní RNAsy byly tyto miRNA navrženy jako diagnostické a prognostické biomarkery onemocnění, včetně rakoviny [16].

   Mezi těmito miRNA byl MiR-185-3p identifikován jako tumor supresorový gen u různých typů rakoviny. Exprese miR-185-3p byla snížena v buňkách rakoviny prsu MDA-MB-231 a MCF-7. Navíc miR-185-3p byl nadměrně exprimován v umlčené transfekci LINC00511, zatímco ve zvýšené transfekci plazmidu LINC00511 byl snížen [17].

   MicroRNA-301a je další oncomiR, který souvisí s progresí nádoru u několika typů rakoviny. Například u rakoviny prostaty, žaludku a také rakoviny slinivky [18-21]. Jeho role u rakoviny prsu však není plně prozkoumána.

   Dlouhé nekódující RNA (LncRNA) jsou ty delší než 200 nukleotidů a mnohé z nich mohou také působit jako primární transkripty pro produkci krátkých RNA. Obecně se LncRNA účastní rolí genové regulace, jako je kompenzace dávkování chromatinu, imprinting, epigenetická regulace, kontrola buněčného cyklu, nukleární a cytoplazmatický transport a buněčná diferenciace [22]. Dále, pre-mRNA interakce, kde primární transkript interaguje s LncRNA a končí s jinou funkční sestřihovou sekvencí nebo je degradován na endogenní malé interferující RNA, miRNA houby, modulace proteinové aktivity nebo lokalizace a usnadnění tvorby riboproteinového komplexu. V neposlední řadě mohou LncRNA stát jako prekurzory pro menší fragmenty, jako jsou miRNA nebo piRNA. Hlavní funkce ciRNA spočívá v zachycování miRNA prostřednictvím komplementárních interakcí, fungujících jako houba miRNA [23]. LncRNA již byly zapojeny do lidských onemocnění včetně rakoviny [24].

   dlouhá intergenická nekódující RNA 00511 (LINC00511); je onkogen, který ovlivňuje velikost nádoru, metastázy a špatnou prognózu. LINC00511 váže histon methyltransferázu EZH2 a specifikuje vzorec modifikace histonů na p57 [25]. Působí také jako onkogen u spinocelulárního karcinomu a pankreatického duktálního adenokarcinomu [26]. Zejména je málo známo, zda LncRNA mohou sloužit jako biomarkery pro prognózu nebo diagnostiku rakoviny. [27] 1.2. Problém: Role těchto biomarkerů není dosud zkoumána v časné diagnostice rakoviny prsu.

   1.3. Hypotéza: Tumor supresor nebo onkogenní biomarkery a LncRNA používané v časné diagnostice rakoviny prsu“

2. Cíl práce:

   Konečným cílem práce je poskytnout jasnější obraz o funkcích miR-185-3p, miR-301a ve spojení s LINC00511 v časné diagnostice nádorů prsu s měřením senzitivity i specificity.

3. Výsledky předchozích studií: na půl straně. Nebyly provedeny žádné předchozí klinické studie z hlediska diagnostického využití studovaných biomarkerů.

4. Problémové prohlášení:

   Role těchto biomarkerů není dosud zkoumána v časné diagnostice karcinomu prsu u egyptských pacientek.

5. Význam výzkumu:

Primární výsledek:

• Identifikovat supresor nádoru v periferní krvi nebo onkogenní malé biomarkery rakoviny prsu a porovnat s normální kontrolní expresí

Sekundární výsledek:

• Vypočítat senzitivitu a specificitu miR-185-3p, miR-301a a LINC00511 ve srovnání s proteinovými markery (CEA a CA15-3) jako diagnostickými markery.

6. Cíle výzkumu:

1. Analyzujte úroveň exprese dvou miRNA (miR-185-3p, miR-301a) a jejich predikované interagované lncRNA (LINC00511) jako minimálních neinvazivních molekulárních markerů pro diagnostiku primárního karcinomu prsu.
2. Porovnejte miR-185-3p, miR-301a a LINC00511 s proteinovými markery (CEA a CA15-3) jako diagnostickými markery, pokud jde o citlivost a specificitu.
3. Studujte vztah mezi miR-185-3p, miR-301a a LINC00511 a klinicko-patologickými znaky rakoviny prsu.
4. Metodika výzkumu:

Tato studie bude nejprve schválena Etickou komisí Farmaceutické fakulty Univerzity Ain Shams a Etickou komisí Národního institutu pro rakovinu v Nové Káhiře. Navíc bude prováděna v souladu s Helsinskou deklarací, kde budou zahrnuty dvě skupiny a všechny subjekty dají písemný souhlas k archivaci.

Skupina 1 kontrolní skupina: Celkem 50 zdravých dobrovolníků, které jsou věkově srovnatelné zdravé dobrovolnice, které netrpí žádnou nemocí ani neužívají žádné léky.

Skupina 2 (Maligní nádor prsu): 50 žen s nemetastatickým primárním karcinomem prsu Pacientky s nedávno diagnostikovanou diagnózou, které dosud nepodstoupily žádnou chemoterapii ani radioterapii, navštěvující National Cancer Institute, New Cairo.

Pro všechny případy a kontrolu bude odebrána úplná historie. Pro analýzu dat budou shromážděny charakteristiky pacientek s rakovinou prsu s ohledem na věk, menopauzální stav, histopatologický typ, velikost nádoru, metastázy v lymfatických uzlinách a stupeň nádoru, stejně jako estrogenový receptor (ER) a progesteronový receptor (PR).

Kritéria vyloučení

Pacienti s:

• Onemocnění z krevních poruch, - Jakákoli jiná rakovina než rakovina prsu
• Cirhóza jater, onemocnění dělohy a močového měchýře

Metody:

Rutinní práce:

Odběr krve:

5 ml krve bude odebráno do obyčejných vakuových zkumavek pro přípravu séra. Vzorky séra budou skladovány při -80 ºC až do biochemického hodnocení ve výzkumné laboratoři oddělení biochemie, Farmaceutická fakulta Univerzity Ain Shams.

Test miR-185-3p, miR-301a a LINC00511 pomocí kvantitativní PCR:

MiRNA a LncRNA budou extrahovány ze séra pomocí Qiagen miRNeasy Mini Kit podle protokolu výrobců a jejich koncentrace a čistoty budou detekovány nanokapkovým spektrofotometrem.

Obohacená RNA bude reverzně transkribována pomocí sady pro reverzní transkripci miroRNA nebo LncRNA podle protokolu výrobce.

Exprese miRNA a LncRNA bude kvantifikována pomocí qRT-PCR s použitím testovacích souprav pro lidské MicroRNA a LncRNAs a jejich specifických primerů.

Hladiny exprese zkoumané miRNA budou hodnoceny pomocí metody ∆Ct [28]. Hodnota prahu cyklu (Ct) je počet cyklů qPCR potřebných k tomu, aby fluorescenční signál překročil specifický práh. ∆Ct bude vypočteno odečtením hodnot Ct RNU6-2 a GAPDH od hodnot zkoumaných miRNA a LncRNA, v daném pořadí. ∆∆Ct se vypočte odečtením ∆Ct kontrolních vzorků od ∆Ct vzorků rakoviny.

Vyšetření hormonálních receptorů a nádorových markerů na bázi proteinů: Jak estrogenový receptor, progesteronový receptor, tak receptor 2 pro lidský epidermální růstový faktor (HER-2neu), kromě nádorových markerů CEA a CA15.3 pomocí souprav ELISA budou získány z National Cancer Institute , Nová Káhira.

ODHAD VELIKOSTI VZORKU Cílem této studie je prozkoumat roli některých cirkulujících MiRNA z nezávislé kontroly a případů rakoviny prsu s 1 kontrolou na experimentální subjekt. Na základě předchozí studie (Hu et al. 2012) byla exprese onkogenních malých biomarkerů normálně distribuována se standardní odchylkou 2,9 a velikostí velkého účinku (1,09). Pokud jsou skutečné rozdíly mezi průměrem skupiny s rakovinou prsu a kontrolní skupiny 2,25, budeme muset studovat 25 experimentálních subjektů a 25 kontrolních subjektů, abychom byli schopni zamítnout nulovou hypotézu, že průměry populace experimentální a kontrolní skupiny jsou stejné s pravděpodobností ( výkon) 0,8. Pravděpodobnost chyby typu I spojená s tímto testem této nulové hypotézy je 0,05.

Pokud jde o tumor supresorový expresní prostředek, byl normálně distribuován s velkou velikostí účinku (1,4). Pokud jsou skutečné rozdíly v průměru skupiny s rakovinou prsu a kontrolní skupiny 14, budeme muset studovat 15 experimentálních subjektů a 15 kontrolních subjektů, abychom byli schopni zamítnout nulovou hypotézu, že průměry populace experimentální a kontrolní skupiny jsou stejné s pravděpodobností ( výkon) 0,8. Pravděpodobnost chyby typu I spojená s tímto testem této nulové hypotézy je 0,05.

Celková velikost vzorku bude 80 případů, tento počet se zvýší o 25 % o očekávané ztráty a celkový vzorek bude 100 subjektů, 50 subjektů na skupinu.

Odhad velikosti vzorku byl proveden pomocí kalkulátoru velikosti vzorku G power*.

Statistická analýza:

K provádění statistických analýz bude použit softwarový balík SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL). K porovnání rozdílu spojitých proměnných ve dvou skupinách podle potřeby bude použit T-test nebo Mann-Whitneyův U test. K porovnání rozdílu kategoriálních proměnných bude použita Pearsonova chí-kvadrát analýza nebo Fisherův exaktní test. Křivka operační charakteristiky přijímače (ROC) a plocha pod křivkou ROC (AUC) budou vyneseny do grafu, aby se určil nejlepší hraniční bod, který rozlišuje mezi skupinami s rakovinou a skupinami bez rakoviny; citlivosti a specificity budou vypočteny pro miRNA a jejich diagnostická účinnost. Pro všechny analýzy bude dvoustranná hodnota P 0,05 nebo méně považována za statisticky významnou.

5. Časový plán/rámec výzkumu i. Časový plán Q/rok Opatření Q1 Příprava oficiálních dokumentů pro odběr vzorků, sběr dat a etické schválení a výpočet velikosti vzorku pro kontrolu a pacienty Q2 Odběr vzorků od pacientů s vybranými kritérii a separace séra v alikvotech Q3 Pokračovat v odběrech vzorků a separaci sérum v alikvotech + extrakce RNA ze vzorků Q4 Odběr kontrolních vzorků a extrakce RNA Q1 Syntéza cDNA pro všechny vzorky + qPCR Q2 Statistická analýza dat a zahájení psaní práce + sborník souvisejících článků pro psaní diplomové práce Q3 Publikace práce a dokončení práce k revizi

ii. Název příspěvku: "Diagnostická užitečnost supresorů nádorů nebo onkogenních malých biomarkerů ve spojení s LncRNA u rakoviny prsu"

autoři:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Odpovídající předkládající autor: Prof. Nadia M. Hamdy První autor: Marwa M. Mohamed Přispívající autor(i): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Seznam referencí:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall a J. Reen, "Detekce rakoviny prsu pomocí hlubokých konvolučních neuronových sítí a podpůrných vektorových strojů," PeerJ, sv. 7, str. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr a J. A. Margenthaler, "Molecular profiling of breast cancer", "Surgical Oncology Clinics of North America, sv. 23, č. 3. Pp. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar, "Léčba metastatického karcinomu prsu", "v JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, sv. 12, č. 5 SUPPL., str. 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith a D. C. Tomlinson, "Multidrug-rezistentní rakovina prsu: Současné perspektivy", "Breast Cancer: Targets and Therapy, sv. 6, č. 0. Pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal a kol., "Krajina somatických mutací v 560 celogenomových sekvencích rakoviny prsu", "Nature, sv. 534, č.p. 7605, str. 47-54, 2016.
6. M. T. Maurano a kol., "Systematická lokalizace variací v regulační DNA spojené s běžnými onemocněními," Science (80-.), sv. 337, č.p. 6099, str. 1190-1195, 2012.
7. M. V. Iorio a C. M. Croce, „Dysregulace mikroRNA u rakoviny: Diagnostika, monitorování a terapie. Komplexní přehled „EMBO Molecular Medicine, sv. 4, č. 3. Pp. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi a D. P. Bartel, "The impact of microRNAs on protein output", "Nature, sv. 7209, str. 64-71, 2008.
9. L. P. Lim a kol., "Microarray analýza ukazuje, že některé mikroRNA snižují regulaci velkého počtu cílových mRNA," Nature, sv. 433, č.p. 7027, str. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya a N. Sonenberg, "Mechanismy post-transkripční regulace mikroRNA: Jsou odpovědi v nedohlednu?" Nature Reviews Genetics, sv. 9, č. 2. Pp. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller a H. A. Coller,“ Hledání konzervovaných sekvencí v kódujících oblastech ukazuje, že mikroRNA let-7 se zaměřuje na Dicer v rámci své kódující sekvence, „Proc. Natl. Akad. Sci., sv. 105, č.p. 39, str. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong a J. A. Steitz, "Přechod od represe k aktivaci: MicroRNAs can up-regulate translation", "Science (80-.), sv. 318, č.p. 5858, str. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek a A. T. Remaley, "MikroRNA jsou transportovány v plazmě a dodávány do buněk příjemce pomocí lipoproteinů s vysokou hustotou, "Nat. Cell Biol., sv. 13, č. 4, str. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee a J. O. Lotvall, „Exosomem zprostředkovaný přenos mRNA a mikroRNA je nový mechanismus genové výměny mezi buňkami,“ Nat. Cell Biol., sv. 9, č. 6, str. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg a kol., "Funcional delivery of viral miRNAs via exosomes," Proc. Natl. Akad. Sci., sv. 107, č.p. 14, str. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz a B. Burwinkel, "Extracelulární miRNA: Záhada jejich původu a funkce", "Trends Biochem. Sci., sv. 37, č.p. 11, str. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin a F. J. Slack, "Sérum pravdy pro rakovinu ---- mikroRNA mají velký potenciál jako biomarkery rakoviny," Cell Res., sv. 18, č. 10, str. 983-984, 2008.
18. Lu a kol., „Journal of Experimental & Clinical Cancer Research“ (2018)
19. Cui, L. a kol. Exprese MicroRNA-301a a její funkční role u maligního melanomu. Buněčná fyziologie a biochemie: mezinárodní časopis experimentální buněčné fyziologie, biochemie a farmakologie 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. Zvýšená exprese mikroRNA-301a u nemalobuněčného karcinomu plic a její klinický význam. Journal of cancer research and therapeutics 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. a kol. miR-301a podporuje proliferaci buněk rakoviny pankreatu přímou inhibicí exprese Bim. Journal of cellular biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. a kol. Modulace tumorigeneze prozánětlivou mikroRNA miR-301a u myších modelů rakoviny plic a kolorektálního karcinomu. Objev buňky 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski a H. Y. Chang, "Long noncoding RNAs and human disease," Trends in Cell Biology, sv. 21, č.6. pp. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov a I. Berindan-Neagoe, "Cílení ncRNA rostlinnými sekundárními metabolity: Hra ncRNA v rovnováze směrem k inhibici malignity", "Biotechnology advances, sv. 36, č. 6. Pp. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo a R. Johnson, "Dlouhá nekódující rnas: Nová (p)vrstva v 'temné hmotě, "Frontiers in Genetics, sv. 2, č. leden 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 interaguje s miR-765 a moduluje progresi spinocelulárního karcinomu jazyka zacílením na LAMC2. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 působí jako konkurenční endogenní RNA pro regulaci exprese VEGFA prostřednictvím houbovitého hsa-miR-29b-3p u pankreatického duktálního adenokarcinomu. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim a kol., "Korelace ultrazvukových ploutví s histologií, stupněm nádoru a biologickými markery u rakoviny prsu," ActaOncol. (Madar)., sv. 47, č.p. 8, str. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig a G. Campbell, „Plochy provozních charakteristik přijímače (ROC): Zásadní nástroj hodnocení v klinické medicíně, „Clinical Chemistry, sv. 39, č. 4. Pp. 561-577, 1993.

(30) Hu, Z. B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) Profilování mikroRNA v séru a prsa riziko rakoviny: použití miR-484/191 jako endogenní kontroly. Carcinogenesis, 33, 828-834.