LINC00511/miR-185-3p 유방암 진단을 위한 축 및 miR-301a-3p 마커

1. 소개 1.1. 배경: 유방암은 전 세계적으로 여성의 주요 사망 원인 중 하나이며, 세계보건기구(WHO)에 따르면 2025년에 예상되는 암 발병 건수는 1,930만 건이 될 것으로 예상됩니다. 이집트에서는 암, 특히 유방암이 증가하는 문제입니다[1].

   유방암은 가장 흔한 여성 악성종양으로 여성의 건강에 큰 위협이 되며, 발병은 상당히 공격적인 국소 침범, 조기 전이, 화학요법에 대한 다제 내성 등을 보인다[2, 3]. 따라서, 유방암의 조기 발견을 위한 최소 침습적 표지자의 개발은 큰 관심을 끌고 있다.

   암 게놈 아틀라스(TCGA)는 암에서 발견되는 많은 돌연변이와 복제수 변화가 단백질 코딩 유전자와 겹치지 않지만[4] 비코딩 DNA(비코딩 RNA 유전자 포함)에 자주 위치한다는 사실을 밝혔습니다[5] . MicroRNA(miRNA)는 암을 조사한 최초의 비코딩 RNA 중 하나였으며 암의 치료 표적 또는 바이오마커로서의 역할을 담당했습니다[6].

   MiRNA는 다양한 생리학적 및 발달 과정에서 유전자 발현을 제어하는 ​​짧은 단일 가닥 RNA 서열(보통 19-23개 뉴클레오티드)로, 광범위한 생물학적 시스템에서 유전자 발현의 전사 후 조절에 중요한 역할을 합니다. 8]. MiRNA는 3'-UTR의 상보적 서열에 대한 염기쌍 결합을 통해 표적 mRNA의 억제를 중재하여 전사체 불안정화, 번역 억제 또는 둘 다를 유발합니다[9]. miRNA는 또한 단백질 코딩 엑손을 포함한 다른 영역에 결합하여 유전자 발현을 조절하고[10] 심지어 포유동물 세포에서 유전자 발현을 유도할 수도 있는 것으로 보고되었습니다[11].

   무세포 순환 miRNA는 일반적으로 리보핵산 단백질 복합체 또는 고밀도 지질단백질에 결합되어 존재하거나 지질 소포, 미세 소포, 엑소솜 또는 세포사멸체의 세포에서 방출됩니다[12-15]. 따라서 순환 miRNA는 세포의 항상성 반응을 반영할 수 있습니다. 유기체뿐만 아니라 질병 진행의 징후. 내인성 RNAse 활성에 대한 안정성과 저항성으로 인해 이러한 miRNA는 암을 포함한 질병의 진단 및 예후 바이오마커로 제안되었습니다[16].

   이러한 miRNA 중에서 MiR-185-3p는 다양한 유형의 암에서 종양 억제 유전자로 확인되었습니다. 유방암 세포 MDA-MB-231 및 MCF-7에서는 miR-185-3p의 발현이 감소했습니다. 더욱이, miR-185-3p는 LINC00511 침묵 형질감염에서 과발현되는 반면, 강화된 LINC00511 플라스미드 형질감염에서는 감소했습니다[17].

   MicroRNA-301a는 여러 유형의 암에서 종양 진행과 관련된 또 다른 oncomir입니다. 예를 들어 전립선암, 위암, 췌장암 등이 있다[18-21]. 그러나 유방암에서의 역할은 완전히 조사되지 않았습니다.

   긴 비암호화 RNA(LncRNA)는 200개의 뉴클레오티드보다 긴 RNA이며, 이들 중 다수는 짧은 RNA를 생성하는 1차 전사체 역할도 할 수 있습니다. 일반적으로 LncRNA는 염색질 투여량 보상, 각인, 후성유전학적 조절, 세포 주기 조절, 핵 및 세포질 수송, 세포 분화와 같은 유전자 조절 역할과 관련되어 있습니다. 또한, 1차 전사체가 LncRNA와 상호작용하고 다른 기능적 스플라이싱 서열로 끝나거나 내인성 소형 간섭 RNA, miRNA 스폰지, 단백질 활성 조절 또는 위치화 및 리보단백질 복합체 형성 촉진으로 분해되는 사전 mRNA 상호작용. 최소한 LncRNA는 miRNA 또는 piRNA와 같은 작은 조각의 전구체 역할을 할 수 있습니다. ciRNA의 주요 기능은 miRNA 스폰지처럼 기능하는 보완적인 상호 작용을 통해 캡처하는 miRNA로 구성됩니다[23]. LncRNA는 이미 암을 비롯한 인간 질병과 관련이 있습니다[24].

   긴 유전자간 비코딩 RNA 00511(LINC00511); 종양 크기, 전이 및 나쁜 예후에 영향을 미치는 종양 유전자입니다. LINC00511은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2에 결합하고 p57에서 히스톤 변형 패턴을 지정합니다[25]. 이는 또한 편평 세포 암종 및 췌관 선암종에서 종양유전자로 작용합니다[26]. 특히 LncRNA가 암 예후나 진단을 위한 바이오마커 역할을 할 수 있는지 여부는 거의 알려져 있지 않습니다. [27] 1.2. 문제: 유방암 조기 진단에서 이러한 바이오마커의 역할은 아직 조사되지 않았습니다.

   1.3. 가설: 유방암 조기 진단에 사용되는 종양억제제 또는 발암성 바이오마커 및 LncRNA"

2. 작업의 목적:

   이 연구의 궁극적인 목적은 민감도와 특이도를 모두 측정하여 유방 종양의 조기 진단에서 LINC00511과 관련하여 miR-185-3p, miR-301a의 기능에 대한 보다 명확한 그림을 제공하는 것입니다.

3. 이전 연구 결과: 반 페이지. 연구된 바이오마커의 진단 유틸리티 측면에 대한 이전 임상 연구는 이루어지지 않았습니다.

4. 문제 설명:

   이집트 환자의 유방암 조기 진단에서 이러한 바이오마커의 역할은 아직 조사되지 않았습니다.

5. 연구의 의의:

주요 결과:

• 말초혈액순환 종양억제인자 또는 발암성 소형 바이오마커 유방암을 확인하고 정상 대조군 발현과 비교

2차 결과:

• 진단 마커로서 단백질 기반 마커(CEA 및 CA15-3)와 비교하여 miR-185-3p, miR-301a 및 LINC00511의 민감도 및 특이성을 계산합니다.

6. 연구 목적:

1. 2개의 miRNA(miR-185-3p, miR-301a)와 예측된 상호작용 lncRNA(LINC00511)의 발현 수준을 원발성 유방암 진단을 위한 최소 비침습적 분자 마커로 분석합니다.
2. 민감도 및 특이성과 관련하여 miR-185-3p, miR-301a 및 LINC00511을 진단 마커로 단백질 기반 마커(CEA 및 CA15-3)와 비교하십시오.
3. miR-185-3p, miR-301a 및 LINC00511과 유방암의 임상병리학적 특성 사이의 관계를 연구합니다.
4. 연구 방법론:

이 연구는 우선 아인 샴스 대학교 약학부 윤리위원회와 뉴카이로 국립암연구소 윤리위원회의 승인을 받게 됩니다. 또한 두 그룹이 포함되고 모든 피험자가 서면 동의를 얻어 보관되는 헬싱키 지침 선언에 따라 수행됩니다.

그룹 1은 대조군: 질병이나 약을 복용하지 않는 건강한 여성 지원자로서 총 50명의 건강한 지원자입니다.

그룹 2(악성 유방 종양): 비전이성 원발성 유방암 여성 50명 최근 뉴 카이로의 국립 암 연구소에 다니는 화학 요법이나 방사선 요법을 아직 받지 않은 것으로 진단받은 환자입니다.

모든 사례와 통제에 대한 전체 기록이 수집됩니다. 데이터 분석을 위해 연령, 폐경기 상태, 조직병리학적 유형, 종양 크기, 림프절 전이 및 종양 등급뿐만 아니라 에스트로겐 수용체(ER) 및 프로게스테론 수용체(PR)와 관련된 유방암 환자의 특성을 수집합니다.

제외 기준

다음과 같은 환자:

• 혈액질환, 유방암 이외의 모든 암
• 간경화, 자궁 및 방광 질환

행동 양식:

일상적인 작업:

혈액 샘플링:

혈청 준비를 위해 혈액 5ml를 일반 진공관에 수집합니다. 혈청 샘플은 Ain Shams University 약학부 생화학부 연구실에서 생화학적 평가가 이루어질 때까지 -80°C에 보관됩니다.

정량적 PCR에 의한 miR-185-3p, miR-301a 및 LINC00511 분석:

MiRNA 및 LncRNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen miRNeasy Mini Kit를 사용하여 혈청에서 추출되며 농도와 순도는 나노드롭 분광 광도계로 검출됩니다.

강화된 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 miroRNA 또는 LncRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사됩니다.

miRNA 및 LncRNA의 발현은 인간 MicroRNA 및 LncRNA 분석 키트와 해당 특정 프라이머를 사용하여 qRT-PCR로 정량화됩니다.

조사된 miRNA의 발현 수준은 ΔCt 방법을 사용하여 평가됩니다[28]. 주기 임계값(Ct) 값은 형광 신호가 특정 임계값을 교차하는 데 필요한 qPCR 주기 수입니다. ΔCt는 조사된 miRNA 및 LncRNA의 값에서 RNU6-2 및 GAPDH의 Ct 값을 각각 빼서 계산됩니다. ΔΔCt는 암 샘플의 ΔCt에서 대조 샘플의 ΔCt를 빼서 계산됩니다.

호르몬 수용체 및 단백질 기반 종양 마커 검사: ELISA 키트를 사용하는 CEA 및 CA15.3 종양 마커 외에도 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2neu) 모두 국립 암 연구소에서 얻을 수 있습니다. , 뉴 카이로.

샘플 크기 추정 이 연구의 목적은 실험 대상당 1명의 대조군을 사용하여 독립적인 대조군과 유방암 사례에서 순환하는 일부 MiRNA의 역할을 조사하는 것입니다. 이전 연구(Hu et al. 2012)에 따르면 발암성 작은 바이오마커 발현은 표준 편차 2.9와 큰 효과 크기(1.09)로 정규 분포를 보였습니다. 유방암 그룹과 대조군 평균의 실제 차이가 2.25라면 실험군과 대조군의 모집단 평균이 확률과 동일하다는 귀무가설을 기각할 수 있도록 25명의 실험 대상과 25명의 대조군을 연구해야 합니다( 힘) 0.8. 이 귀무 가설 검정과 관련된 제1종 오류 확률은 0.05입니다.

종양 억제인자 발현 수단은 큰 효과 크기(1.4)로 정규 분포를 보였습니다. 유방암 그룹과 대조군 평균의 실제 차이가 14라면 실험군과 대조군의 모집단 평균이 확률과 동일하다는 귀무가설을 기각할 수 있도록 실험 대상자 15명과 대조군 대상자 15명을 연구해야 합니다( 힘) 0.8. 이 귀무 가설 검정과 관련된 제1종 오류 확률은 0.05입니다.

총 표본 크기는 80개 사례가 될 것이며, 이 수는 예상 손실에 대해 25% 증가될 것이며, 총 표본은 100명, 그룹당 50명입니다.

표본 크기 추정은 G power* 표본 크기 계산기를 사용하여 수행되었습니다.

통계 분석:

SPSS 21.0 소프트웨어 패키지(SPSS,Chicago,IL)를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. T-검정 또는 Mann-Whitney의 U 검정을 사용하여 두 그룹의 연속 변수의 차이를 적절하게 비교합니다. 범주형 변수의 차이를 비교하기 위해 Pearson의 카이제곱 분석 또는 Fisher의 정확 검정을 사용합니다. ROC(수신자 작동 특성) 곡선과 ROC 곡선 아래 면적(AUC)을 플롯하여 암 그룹과 비암 그룹을 구별하는 최상의 컷오프 지점을 결정합니다. miRNA 및 진단 효능에 대한 민감도와 특이성이 계산됩니다. 모든 분석에서 0.05 이하의 양측 P 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

5. 연구 기간 계획/프레임 i. 시간 계획 분기/연도 조치 Q1 검체 수집, 데이터 수집 및 윤리적 승인을 위한 공식 문서 준비 및 대조군과 환자의 검체 크기 계산 Q2 선택된 기준에 따라 환자로부터 검체 채취 및 분취량으로 혈청 분리 Q3 검체 수집 및 분리를 계속 혈청 내 혈청 + 시료에서 RNA 추출 Q4 대조 시료 수집 및 RNA 추출 Q1 모든 시료에 대한 cDNA 합성 + qPCR Q2 데이터 통계 분석 및 논문 작성 시작 + 논문 작성을 위한 관련 기사 모음 Q3 출판 논문 작성 및 수정을 위한 논문 마무리

ii. 논문 제목: "유방암에서 LncRNA와 관련된 종양억제제 또는 발암성 소형 바이오마커의 진단 유틸리티"

저자:

Marwa M. Mohamed, Eman Fouad Sanad 박사, Reham Ali Abbas El-Shimy 박사, Nadia M. Hamdy.

교신 제출 저자: Nadia M. Hamdy 교수 제1 저자: Marwa M. Mohamed 기여 저자(들): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

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