LINC00511/miR-185-3p Axis és miR-301a-3p markerek a mellrák diagnosztizálásához

1. Bevezetés 1.1. Háttér: A mellrák világszerte az egyik vezető halálok a nők körében, az Egészségügyi Világszervezet (WHO) szerint 2025-ben 19,3 millióra várható a rákos megbetegedések száma. Egyiptomban egyre nagyobb probléma a rák, különösen a mellrák [1].

   Az emlőrák a leggyakoribb női rosszindulatú daganat, amely komoly veszélyt jelent a nők egészségére, kialakulása pedig a jelentős mértékben agresszív lokális invázió, a korai áttétek és a kemoterápiával szembeni multidrog rezisztencia [2, 3]. Ezért az emlőrák korai felismerésére szolgáló, minimálisan invazív markerek fejlesztése nagy érdeklődésre tart számot.

   A rákos genom Atlas (TCGA) kimutatta, hogy a rákban talált mutációk és kópiaszám-változások közül sok nem fedi át a fehérjét kódoló géneket [4], hanem gyakran nem kódoló DNS-ben találhatók, beleértve a nem kódoló RNS-géneket is [5]. . A mikroRNS-ek (miRNS-ek) az első nem kódoló RNS-ek közé tartoztak, amelyeket a rákos megbetegedésekben, valamint terápiás célpontként vagy biomarkerként betöltött szerepüket vizsgálták [6].

   A MiRNS-ek rövid, egyszálú RNS-szekvenciák (általában 19-23 nukleotidból állnak), amelyek számos fiziológiai és fejlődési folyamatban szabályozzák a génexpressziót, így kritikus szerepet játszanak a génexpresszió poszttranszkripciós szabályozásában a biológiai rendszerek széles körében [7, 8]. A MiRNS-ek a 3'-UTR komplementer szekvenciájához bázispárosodással közvetítik a cél-mRNS represszióját, ami transzkriptum destabilizációt, transzlációs repressziót vagy mindkettőt okoz [9]. Beszámoltak arról, hogy a miRNS-ek a génexpressziót is módosítják azáltal, hogy más régiókhoz kötődnek, beleértve a fehérjét kódoló exonokat [10], és akár génexpressziót is indukálhatnak emlőssejtekben [11].

   A sejtmentesen keringő miRNS-ek általában ribonukleoproteinek komplexekhez vagy nagy sűrűségű lipoproteinekhez kötve léteznek, vagy lipidvezikulákban, mikrovezikulákban, exoszómákban vagy apoptotikus testekben szabadulnak fel a sejtekből [12-15]. Így a keringő miRNS-ek a sejtek homeosztatikus válaszát tükrözhetik. szervezet, valamint a betegség progressziójának jelei. Stabilitásuk és az endogén RNS-áz aktivitással szembeni rezisztenciájuk miatt ezeket a miRNS-eket diagnosztikai és prognosztikai biomarkerekként javasolták betegségekre, beleértve a rákot is [16].

   Ezen miRNS-ek közül a MiR-185-3p-t tumorszuppresszor génként azonosították különböző ráktípusokban. A miR-185-3p expressziója csökkent az MDA-MB-231 és MCF-7 emlőrák sejtekben. Ezenkívül a miR-185-3p túlzottan expresszálódott a LINC00511 elnémított transzfekcióban, míg csökkent a fokozott LINC00511 plazmid transzfekcióban [17].

   A MicroRNS-301a egy másik oncomiR, amely összefüggésben áll a daganat progressziójával számos ráktípusban. Például prosztatarákban, gyomorrákban, valamint hasnyálmirigyrákban [18-21]. Az emlőrákban betöltött szerepét azonban nem vizsgálták teljesen.

   A hosszú, nem kódoló RNS-ek (LncRNS-ek) azok, amelyek 200 nukleotidnál hosszabbak, és sokuk primer transzkriptumként is működhet rövid RNS-ek előállításához. Általában az LncRNS-ek szerepet játszanak a génszabályozó szerepekben, mint például a kromatin dózis kompenzációjában, imprintingben, epigenetikai szabályozásban, sejtciklus szabályozásban, nukleáris és citoplazmatikus kereskedelemben és sejtdifferenciálódásban [22]. Továbbá pre-mRNS kölcsönhatás, ahol az elsődleges transzkriptum kölcsönhatásba lép az LncRNS-ekkel, és egy másik funkcionális splicing szekvenciával végződik, vagy endogén kis interferáló RNS-ekké, miRNS-szivacsokká bomlik le, a fehérjeaktivitás modulálása vagy lokalizációja és a riboprotein komplex képződésének elősegítése. A legkevésbé sem, az LncRNS-ek kisebb fragmensek, például miRNS-ek vagy piRNS-ek prekurzorai lehetnek. A ciRNS-ek fő funkciója abban áll, hogy a miRNS-eket komplementer kölcsönhatásokon keresztül befogják, miRNS-szivacsként működve [23]. Az LncRNS-ek már érintettek emberi betegségekben, beleértve a rákot is [24].

   Hosszú intergénikus nem kódoló RNS 00511 (LINC00511); egy onkogén, amely befolyásolja a daganat méretét, metasztázisát és rossz prognózist. A LINC00511 megköti az EZH2 hiszton-metiltranszferázt, és meghatározza a hiszton módosulási mintázatát a p57-en [25]. Onkogénként hat laphámsejtes karcinómában és hasnyálmirigy-ductalis adenokarcinómában is [26]. Különösen keveset tudunk arról, hogy az LncRNS-ek biomarkerként szolgálhatnak-e a rák prognózisához vagy diagnózisához. [27] 1.2. Probléma: Ezeknek a biomarkereknek a szerepét még nem vizsgálták az emlőrák korai diagnózisában.

   1.3. Hipotézis: Tumor szuppresszor vagy onkogén biomarkerek és LncRNS az emlőrák korai diagnosztizálásában

2. A munka célja:

   A munka végső célja, hogy tisztább képet adjon a miR-185-3p, a miR-301a funkcióiról a LINC00511-gyel összefüggésben az emlődaganatok korai diagnosztizálásában, mind az érzékenység, mind a specificitás mérésével.

3. Korábbi tanulmányok megállapításai: fél oldalon. Korábbi klinikai vizsgálatok nem készültek a vizsgált biomarkerek diagnosztikai hasznosságáról.

4. Problémanyilatkozat:

   Ezeknek a biomarkereknek a szerepét még nem vizsgálták az emlőrák korai diagnózisában egyiptomi betegeknél.

5. Kutatási jelentősége:

Elsődleges eredmény:

• A perifériás vérben keringő tumorszuppresszor vagy onkogén kis biomarkeres emlőrák azonosítása és összehasonlítása a normál kontroll expresszióval

Másodlagos eredmény:

• A miR-185-3p, miR-301a és LINC00511 szenzitivitásának és specificitásának kiszámítása a fehérje alapú markerekkel (CEA és CA15-3) mint diagnosztikai markerekkel összehasonlítva.

6. Kutatási célok:

1. Elemezze két miRNS (miR-185-3p, miR-301a) és előre jelzett kölcsönhatásba lépő lncRNS-ének (LINC00511) expressziós szintjét, mint minimális noninvazív molekuláris markereket az elsődleges emlőrák diagnosztizálásához.
2. Hasonlítsa össze a miR-185-3p-t, a miR-301a-t és a LINC00511-et a fehérje alapú markerekkel (CEA és CA15-3), mint diagnosztikai markerekkel az érzékenység és a specificitás tekintetében.
3. Vizsgálja meg a miR-185-3p, a miR-301a és a LINC00511 kapcsolatát, valamint az emlőrák klinikopatológiai jellemzőit.
4. Kutatásmódszertan:

Ezt a tanulmányt először az Ain Shams Egyetem Gyógyszerészeti Karának Etikai Bizottsága és az új-kairói Nemzeti Rákintézet Etikai Bizottsága hagyja jóvá. Ezenkívül a Helsinki Irányelvek Nyilatkozatának megfelelően hajtják végre, amelyben két csoport szerepel, és minden alany írásos beleegyezését adja az archiváláshoz.

1. csoport a kontrollcsoport: Összesen 50 egészséges önkéntes, akik életkoruknak megfelelő egészséges női önkéntesek, akik nem szenvednek semmilyen betegségben és nem szednek semmilyen gyógyszert.

2. csoport (rosszindulatú emlődaganat): 50, nem áttétes primer emlőrákban szenvedő nő. A közelmúltban diagnosztizált betegek, akik még nem kaptak kemoterápiát vagy sugárterápiát az új-kairói National Cancer Institute-ban.

A teljes előzményeket minden esetre és ellenőrzésre vonatkozóan rögzítjük. Adatelemzés céljából összegyűjtjük az emlőrákos betegek jellemzőit az életkor, a menopauzális állapot, a kórszövettani típus, a tumor méret, a nyirokcsomó-áttét és a tumor fokú, valamint az ösztrogén receptor (ER) és progeszteron receptor (PR) tekintetében.

Kizárási kritériumok

Betegek:

• Vérrendszeri rendellenességek, - Bármely rák, kivéve a mellrákot
• Májcirrhosis, méh- és húgyhólyag-betegségek

Mód:

Rutinmunka:

Vérvétel:

5 ml vért sima vaccutainer csövekbe gyűjtünk a szérum elkészítéséhez. A szérummintákat -80 ºC-on tárolják a biokémiai értékelésig az Ain Shams Egyetem Gyógyszerészeti Karának Biokémiai Tanszékének Kutatólaboratóriumában.

A miR-185-3p, miR-301a és LINC00511 vizsgálata kvantitatív PCR-rel:

A MiRNS-t és az LncRNS-t a szérumból a Qiagen miRNeasy Mini Kit segítségével vonják ki a gyártó protokollja szerint, koncentrációjukat és tisztaságukat nanocsepp spektrofotométerrel határozzák meg.

A dúsított RNS reverz átírása miroRNS vagy LncRNAs reverz transzkripciós kittel történik a gyártó protokollja szerint.

A miRNS és LncRNS expresszióját qRT-PCR-rel határozzuk meg humán MicroRNS és LncRNAs assay kit és specifikus primerek felhasználásával.

A vizsgált miRNS expressziós szintjét a ∆Ct módszerrel értékeljük [28]. A ciklusküszöb (Ct) értéke a qPCR-ciklusok száma, amelyek szükségesek ahhoz, hogy a fluoreszcens jel átlépjen egy adott küszöböt. A ∆Ct kiszámításához az RNU6-2 és a GAPDH Ct értékét levonjuk a vizsgált miRNS-ek és LncRNS-ek Ct értékéből. A ∆∆Ct kiszámítása úgy történik, hogy a kontrollminták ∆Ct értékét kivonjuk a rákos minták ∆Ct értékéből.

Hormonreceptorok és fehérjealapú tumormarkerek vizsgálata: Mind az ösztrogénreceptort, a progeszteronreceptort, mind a humán epidermális növekedési faktor receptor 2-t (HER-2neu), valamint a CEA és CA15.3 tumormarkereket ELISA készletekkel a National Cancer Institute-tól szerezzük be. , Új Kairó.

MINTAMÉRET BECSLÉSE A tanulmány célja néhány keringő MiRNS szerepének vizsgálata független kontrollból és emlőrákos esetekből, kísérleti alanyonként 1 kontrollal. Korábbi tanulmányok (Hu et al. 2012) alapján az onkogén kis biomarkerek expressziója normális eloszlású volt 2,9 szórással és nagy hatásmérettel (1,09). Ha az emlőrákos csoport és a kontrollcsoport átlaga közötti valódi különbség 2,25, akkor 25 kísérleti alanyt és 25 kontroll egyént kell megvizsgálnunk, hogy el tudjuk utasítani azt a nullhipotézist, miszerint a kísérleti és a kontrollcsoport populációs átlaga egyenlő valószínűséggel ( teljesítmény) 0,8. Ennek a nullhipotézisnek a tesztjéhez kapcsolódó I. típusú hiba valószínűsége 0,05.

Ami a tumorszuppresszort illeti, az expressziós átlag normálisan nagy hatásmérettel oszlott el (1,4). Ha a valódi különbség az emlőrákos csoport és a kontrollcsoport átlagai között 14, akkor 15 kísérleti alanyt és 15 kontroll egyént kell megvizsgálnunk, hogy el tudjuk utasítani azt a nullhipotézist, miszerint a kísérleti és a kontrollcsoport populációs átlaga egyenlő valószínűséggel ( teljesítmény) 0,8. Ennek a nullhipotézisnek a tesztjéhez kapcsolódó I. típusú hiba valószínűsége 0,05.

A teljes mintanagyság 80 eset lesz, ezt a számot 25%-kal növeljük a várható veszteségek miatt, a teljes minta pedig 100 alany, csoportonként 50 alany.

A mintanagyság becslését G power* mintaméret kalkulátorral végeztük.

Statisztikai analízis:

A statisztikai elemzések elvégzéséhez SPSS 21.0 szoftvercsomagot (SPSS,Chicago,IL) használunk. A T-próbát vagy a Mann-Whitney-féle U-tesztet alkalmazzuk a folytonos változók különbségének összehasonlítására két csoportban. A Pearson-féle Chi-négyzet analízist vagy Fisher-féle egzakt tesztet alkalmazzuk a kategorikus változók különbségének összehasonlítására. A vevő működési jellemzői (ROC) görbéjét és a ROC-görbe alatti területet (AUC) felrajzolják, hogy meghatározzák a legjobb küszöbpontot, amely megkülönbözteti a rákos és nem rákos csoportokat; a miRNS-ek szenzitivitását és specificitását kiszámítjuk, valamint diagnosztikai hatékonyságukat. Minden elemzés esetében a 0,05 vagy annál kisebb kétirányú P-érték statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.

5. Kutatási időterv/keret i. Időterv Q/év Intézkedések Q1 Hivatalos dokumentumok elkészítése a mintavételhez, az adatgyűjtéshez és az etikai jóváhagyáshoz, valamint a minta méretének kiszámítása a kontroll és a betegek számára Q2 Mintavétel a betegektől kiválasztott kritériumok szerint és a szérum szétválasztása aliquotokban Q3 A mintagyűjtés és a betegek elkülönítése. szérum alikvotokban + RNS kinyerése a mintákból Q4 Kontroll minták gyűjtése és RNS extrahálása Q1 cDNS szintézis minden mintára + qPCR Q2 Az adatok statisztikai elemzése és a dolgozat írásának megkezdése + kapcsolódó cikkek gyűjteménye a szakdolgozat megírásához Q3 a dolgozat elkészítése és a szakdolgozat lektorálása

ii. A közlemény címe: "A tumorszuppresszor vagy az onkogén kis biomarkerek diagnosztikai hasznossága az LncRNS-sel kapcsolatban emlőrákban"

Szerzői:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Megfelelő benyújtó szerző: Prof. Nadia M. Hamdy Első Szerző: Marwa M. Mohamed Közreműködő szerző(k): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Hivatkozások listája:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall és J. Reen "Mellrák kimutatása mély konvolúciós neurális hálózatok és támogató vektorgépek segítségével", PeerJ, vol. 7. o. e6201, 2019.
2. A. E. Cyr és J. A. Margenthaler, Molecular profiling of mell cancer, Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 23. sz. 3. Pp. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar: A metasztatikus mellrák kezelése, JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, vol. 12, sz. 5 SUPPL., pp., 759-761.
4. H. L. Martin, L. Smith és D. C. Tomlinson, "Multidrug-rezisztens mellrák: jelenlegi perspektívák", "Breast Cancer: Targets and Therapy, vol. 6, sz. 0. Pp. 2014. 1-13.
5. S. Nik-Zainal és munkatársai, "Szomatikus mutációk tájképe 560 mellrák teljes genomszekvenciájában", "Nature, vol. 534. sz. 7605, pp. 2016. 47-54.
6. M. T. Maurano és munkatársai, "Systematicc localization of common disease-asssociated variation in regulatory DNA", Science (80-.), vol. 337. sz. 6099, pp. 1190-1195, 2012.
7. M. V. Iorio és C. M. Croce, "MicroRNS diszreguláció a rákban: Diagnosztika, monitorozás és terápia. Átfogó áttekintés: „EMBO Molecular Medicine, vol. 4, sz. 3. Pp. 2012., 143-159.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F. D. Camargo, S. P. Gygi és D. P. Bartel, "The Impact of microRNAs on protein output", "Nature, vol. 7209, pp. 2008. 64-71.
9. L. P. Lim és munkatársai: "A Microarray elemzés azt mutatja, hogy egyes mikroRNS-ek leszabályozzák a cél-mRNS-ek nagy számát, "Nature, vol. 433. sz. 7027, pp. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, S. N. Bhattacharyya és N. Sonenberg, "Mechanisms of post-transscriptional Regulation by microRNAs: Are the Answers in sight?" Nature Reviews Genetics, vol. 9, sz. 2. Pp. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller és H. A. Coller "A kódoló régiókban konzervált szekvenciák keresése azt mutatja, hogy a let-7 mikroRNS a kódoló szekvenciáján belül a Dicert célozza meg, "Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 105, sz. 39. o. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong és J. A. Steitz: „Váltás az elfojtásról az aktiválásra: A mikroRNS-ek képesek felfelé szabályozni a transzlációt, „Science (80-.), vol. 318. sz. 5858, pp. 1931-1934, 2007.
13. K. C. Vickers, B. T. Palmisano, B. M. Shoucri, R. D. Shamburek és A. T. Remaley: "A mikroRNS-eket a plazmában szállítják, és nagy sűrűségű lipoproteinek segítségével juttatják el a recipiens sejtekhez, "Nat. Cell Biol., vol. 13. sz. 4, pp. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, J. J. Lee és J. O. Lotvall: "Az mRNS és a mikroRNS-ek exoszóma által közvetített transzfere a sejtek közötti genatikus csere új mechanizmusa. "Nat. Cell Biol., vol. 9, sz. 6, pp. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg és munkatársai, "Vírusos miRNS-ek funkcionális szállítása exoszómákon keresztül", "Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 107. sz. 14, pp. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz és B. Burwinkel, "Extracelluláris miRNS-ek: Eredetük és működésük rejtélye", "Trends Biochem. Sci., vol. 37. sz. 11. o. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin és F. J. Slack: "A rák igazságszéruma ---- A mikroRNS-ek jelentős potenciállal bírnak rák biomarkerként", Cell Res., vol. 18, sz. 10, pp. 983-984, 2008.
18. Lu et al, "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research" (2018)
19. Cui, L. et al. A MicroRNA-301a expressziója és funkcionális szerepei rosszindulatú melanomában. Cellular physiology and Biochemistry: International Journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y. K., Zang, Q. L., Li, G. X., Huang, Y. & Wang, S. Z. A microRNA-301a fokozott expressziója nem kissejtes tüdőrákban és annak klinikai jelentősége. Journal of Rákkutatás és terápia 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et al. A miR-301a elősegíti a hasnyálmirigyráksejtek proliferációját azáltal, hogy közvetlenül gátolja a Bim expressziót. Journal of cellular biochemistry 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et al. A tumorigenezis modulálása a gyulladást elősegítő miR-301a mikroRNS által tüdőrák és vastagbélrák egérmodelljeiben. Cell Discovery 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski és H. Y. Chang, "Long noncoding RNAs and human disease", Trends in Cell Biology, vol. 21, 6. sz. pp. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, A. G. Atanasov és I. Berindan-Neagoe, "Célzás ncRNS-ek növényi másodlagos metabolitokkal: Az ncRNS-ek egyensúlyban vannak a rosszindulatú daganatok gátlásával", "Biotechnology advances, vol. 36. sz. 6. Pp. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo és R. Johnson: "A hosszú, nem kódoló rnas: Egy új (p)réteg a "sötét anyagban", "Frontiers in Genetics, vol. 2, sz. 2012. jan.
26. Ding J, Yang C, Yang S. A LINC00511 kölcsönhatásba lép a miR-765-tel, és a LAMC2 megcélzásával modulálja a nyelv laphámsejtes karcinóma progresszióját. J Oral Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. A Linc00511 versengő endogén RNS-ként működik a VEGFA expresszió szabályozásában szivacsos hsa-miR-29b-3p révén hasnyálmirigy ductalis adenocarcinomában. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim és munkatársai, "Az ultrahang finfiningek korrelációja a szövettannal, a tumorfokozattal és az emlőrák biológiai markereivel", "ActaOncol. (Madar)., vol. 47, sz. 8, pp. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig és G. Campbell, "Vevő-működési jellemzők (ROC) diagramok: Egy alapvető kiértékelő eszköz a klinikai gyógyászatban, "Clinical Chemistry, vol. 39. sz. 4. Pp. 561-577, 1993.

(30) Hu, Z. B., J. Dong, L. E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang és H. B. Shen (2012) A szérum mikroRNS profilozása és a mell rák kockázata: a miR-484/191 endogén kontrollként való alkalmazása. Carcinogenesis, 33, 828-834.