LINC00511/miR-185-3p Axis y marcadores miR-301a-3p para el diagnóstico de cáncer de mama

1. Introducción 1.1. Antecedentes: El cáncer de mama es una de las principales causas de muerte de mujeres a nivel mundial, según la organización mundial de la salud (OMS), el número de casos de cáncer esperado en el año 2025 será de 19,3 millones de casos. En Egipto, el cáncer es un problema creciente y especialmente el cáncer de mama [1].

   El cáncer de mama es el tumor maligno femenino más común y una gran amenaza para la salud de las mujeres y su desarrollo es una invasión local considerablemente agresiva, metástasis tempranas y resistencia a múltiples fármacos a la quimioterapia [2, 3]. Por tanto, el desarrollo de marcadores mínimamente invasivos para la detección temprana del cáncer de mama es de gran interés.

   El Atlas del genoma del cáncer (TCGA) reveló que muchas de las mutaciones y cambios en el número de copias que se encuentran en el cáncer no se superponen con los genes codificantes de proteínas [4], sino que con frecuencia se localizan en genes de ADN no codificantes, incluidos genes de ARN no codificantes [5]. . Los microARN (miARN) estuvieron entre los primeros ARN no codificantes en investigarse el cáncer y sus funciones como dianas terapéuticas o biomarcadores en el cáncer [6].

   Los miARN son secuencias cortas de ARN monocatenario (generalmente de 19 a 23 nucleótidos) que controlan la expresión génica en una variedad de procesos fisiológicos y de desarrollo, por lo que tienen un papel fundamental en la regulación postranscripcional de la expresión génica en una amplia gama de sistemas biológicos [7, 8]. Los miARN median la represión del ARNm objetivo mediante el emparejamiento de bases con una secuencia complementaria en la 3'-UTR, lo que provoca desestabilización de la transcripción, represión traduccional o ambas [9]. Se ha informado que los miARN también modulan la expresión génica uniéndose a otras regiones, incluidos los exones que codifican proteínas [10], e incluso pueden inducir la expresión génica en células de mamíferos [11].

   Los miARN circulantes libres de células generalmente existen unidos a complejos de ribonucleoproteínas o lipoproteínas de alta densidad o se liberan de las células en vesículas lipídicas, microvesículas, exosomas o cuerpos apoptóticos [12-15]. Por lo tanto, los miARN circulantes pueden reflejar una respuesta homeostática de la organismo, así como signos de progresión de la enfermedad. Debido a su estabilidad y resistencia a la actividad de la ARNasa endógena, estos miARN se han propuesto como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico de enfermedades, incluido el cáncer [16].

   Entre estos miARN, MiR-185-3p ha sido identificado como un gen supresor de tumores en varios tipos de cáncer. La expresión de miR-185-3p disminuyó en las células de cáncer de mama MDA-MB-231 y MCF-7. Además, miR-185-3p se sobreexpresó en la transfección silenciada LINC00511, mientras que disminuyó en la transfección con plásmido LINC00511 mejorado [17].

   El microARN-301a es otro oncomiR que se ha relacionado con la progresión tumoral en varios tipos de cáncer. Por ejemplo, en el cáncer de próstata, el cáncer gástrico y el cáncer de páncreas [18-21]. Sin embargo, su papel en el cáncer de mama no está completamente investigado.

   Los ARN largos no codificantes (LncRNA) son aquellos que tienen más de 200 nucleótidos y muchos de ellos también pueden actuar como transcritos primarios para producir ARN cortos. En general, los LncRNA se han implicado en funciones reguladoras de genes, como la compensación de la dosis de cromatina, la impresión, la regulación epigenética, el control del ciclo celular, el tráfico nuclear y citoplasmático y la diferenciación celular [22]. Además, la interacción pre-ARNm en la que el transcrito primario interactúa con los LncRNA y termina con una secuencia empalmada funcional diferente o se degrada en pequeños ARN de interferencia endógenos, esponjas de miARN, modulación de la actividad o localización de las proteínas y facilitación de la formación de complejos de riboproteínas. En lo más mínimo, los LncRNA pueden actuar como precursores de fragmentos más pequeños como miRNA o piRNA. La función principal de los ciRNA consiste en capturar miRNA a través de interacciones complementarias, funcionando como una esponja de miRNA [23]. Los LncRNA ya se han implicado en enfermedades humanas, incluido el cáncer [24].

   ARN no codificante intergénico largo 00511 (LINC00511); es un oncogén que influye en el tamaño del tumor, la metástasis y el mal pronóstico. LINC00511 se une a la histona metiltransferasa EZH2 y especifica el patrón de modificación de histonas en p57 [25]. También actúa como oncogén en el carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma ductal pancreático [26]. En particular, se sabe poco si los LncRNA pueden servir como biomarcadores para el pronóstico o diagnóstico del cáncer. [27] 1.2. Problema: el papel de estos biomarcadores aún no se ha investigado en el diagnóstico precoz del cáncer de mama.

   1.3. Hipótesis: Supresores Tumorales o Biomarcadores Oncogénicos y LncRNA utilizados en el diagnóstico precoz del cáncer de mama"

2. Objetivo del Trabajo:

   El objetivo final del trabajo es proporcionar una imagen más clara de las funciones de miR-185-3p, miR-301a, en asociación con LINC00511, en el diagnóstico precoz de tumores de mama midiendo tanto la sensibilidad como la especificidad.

3. Hallazgos de estudios anteriores: en media página. No se realizaron estudios clínicos previos sobre el aspecto de las utilidades diagnósticas de los biomarcadores estudiados.

4. Planteamiento del problema:

   El papel de estos biomarcadores aún no se ha investigado en el diagnóstico precoz del cáncer de mama en pacientes egipcios.

5. Importancia de la investigación:

Resultado primario:

• Identificar el cáncer de mama con supresores tumorales o pequeños biomarcadores oncogénicos circulantes en sangre periférica y compararlo con la expresión de control normal.

Resultado secundario:

• Calcular la sensibilidad y especificidad de miR-185-3p, miR-301a y LINC00511 en comparación con los marcadores basados ​​en proteínas (CEA y CA15-3) como marcadores de diagnóstico.

6. Objetivos de la investigación:

1. Analice el nivel de expresión de dos miARN (miR-185-3p, miR-301a) y su lncRNA interactuado previsto (LINC00511) como marcadores moleculares mínimos no invasivos para diagnosticar el cáncer de mama primario.
2. Compare miR-185-3p, miR-301a y LINC00511 con los marcadores basados ​​en proteínas (CEA y CA15-3) como marcadores de diagnóstico, en cuanto a sensibilidad y especificidad.
3. Estudiar la relación entre miR-185-3p, miR-301a y LINC00511 y los caracteres clínico-patológicos del cáncer de mama.
4. Metodología de investigación:

Este estudio será aprobado primero por el Comité de Ética de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams y por el Comité de Ética del Instituto Nacional del Cáncer de New Cairo. Además, se realizará de conformidad con las Directrices de la Declaración de Helsinki, donde se incluirán dos grupos y todos los sujetos darán su consentimiento por escrito para ser archivado.

Grupo 1, el grupo de control: un total de 50 voluntarias sanas de la misma edad, voluntarias sanas que no padecen ninguna enfermedad ni toman ningún medicamento.

Grupo 2 (Tumor Maligno de Mama): 50 mujeres con cáncer de mama primario no metastásico Pacientes diagnosticadas recientemente que aún no han recibido quimioterapia o radioterapia, que asisten al Instituto Nacional del Cáncer, Nuevo Cairo.

Se tomará el historial completo de todos los casos y controles. Las características de las pacientes con cáncer de mama con respecto a la edad, estado menopáusico, tipo histopatológico, tamaño del tumor, metástasis en los ganglios linfáticos y grado del tumor, así como el receptor de estrógeno (ER) y el receptor de progesterona (PR) se recopilarán para el análisis de datos.

Criterio de exclusión

Pacientes con:

• Enfermedades de trastornos sanguíneos, -Cualquier cáncer que no sea cáncer de mama.
• Cirrosis hepática, enfermedades uterinas y de la vejiga urinaria

Métodos:

Trabajo rutinario:

Muestra de sangre:

Se recogerán 5 ml de sangre en tubos vaccutainer simples para la preparación del suero. Las muestras de suero se almacenarán a -80 ºC hasta la evaluación bioquímica en el Laboratorio de Investigación del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams.

Ensayo de miR-185-3p, miR-301a y LINC00511 mediante PCR cuantitativa:

Los miARN y LncRNA se extraerán del suero utilizando el mini kit Qiagen miRNeasy de acuerdo con el protocolo del fabricante y su concentración y pureza se detectarán mediante un espectrofotómetro de nanogota.

El ARN enriquecido se transcribirá de forma inversa con el kit de transcripción inversa de miroRNA o LncRNA de acuerdo con el protocolo del fabricante.

La expresión de miARN y LncRNA se cuantificará mediante qRT-PCR utilizando kits de ensayo de microARN y LncRNA humanos y sus cebadores específicos.

Los niveles de expresión del miARN investigado se evaluarán mediante el método ∆Ct [28]. El valor del umbral del ciclo (Ct) es el número de ciclos de qPCR necesarios para que la señal fluorescente cruce un umbral específico. ∆Ct se calculará restando los valores de Ct de RNU6-2 y GAPDH de los de los miRNA y LncRNA investigados, respectivamente. El ∆∆Ct se calculará restando el ∆Ct de las muestras de control del ∆Ct de las muestras de cáncer.

Examen de receptores hormonales y marcadores tumorales basados ​​en proteínas: tanto el receptor de estrógeno, el receptor de progesterona y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2neu), además de los marcadores tumorales CEA y CA15.3 utilizando kits ELISA, se obtendrán del Instituto Nacional del Cáncer. , Nuevo Cairo.

ESTIMACIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA El objetivo de este estudio es investigar el papel de algunos MiARN circulantes de controles independientes y casos de cáncer de mama con 1 control por sujeto experimental. Según un estudio anterior (Hu et al. 2012), la expresión de pequeños biomarcadores oncogénicos se distribuyó normalmente con una desviación estándar de 2,9 y un tamaño de efecto grande (1,09). Si las verdaderas diferencias entre las medias del grupo de cáncer de mama y el grupo de control son 2,25, necesitaremos estudiar 25 sujetos experimentales y 25 sujetos de control para poder rechazar la hipótesis nula de que las medias poblacionales de los grupos experimental y de control son iguales con probabilidad ( potencia) 0,8. La probabilidad de error Tipo I asociada con esta prueba de esta hipótesis nula es 0,05.

En cuanto a la expresión del supresor de tumores, la media se distribuyó normalmente con un tamaño del efecto grande (1,4). Si las verdaderas diferencias entre las medias del grupo de cáncer de mama y el grupo de control son 14, necesitaremos estudiar 15 sujetos experimentales y 15 sujetos de control para poder rechazar la hipótesis nula de que las medias poblacionales de los grupos experimental y de control son iguales con probabilidad ( potencia) 0,8. La probabilidad de error Tipo I asociada con esta prueba de esta hipótesis nula es 0,05.

El tamaño total de la muestra será de 80 casos, este número se incrementará en un 25% para las pérdidas esperadas y la muestra total será de 100 sujetos, 50 sujetos por grupo.

La estimación del tamaño de la muestra se realizó mediante la calculadora del tamaño de la muestra de potencia G*.

Análisis estadístico:

Se utilizará el paquete de software SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL) para realizar los análisis estadísticos. Se utilizará la prueba T o la prueba U de Mann-Whitney para comparar la diferencia de variables continuas en dos grupos, según corresponda. Se empleará el análisis de chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher para comparar la diferencia de variables categóricas. La curva de características operativas del receptor (ROC) y el área bajo la curva ROC (AUC) se trazarán para determinar el mejor punto de corte que discrimine entre grupos con y sin cáncer; se calcularán las sensibilidades y especificidades de los miARN y su eficacia diagnóstica. Para todos los análisis, un valor de P de dos colas de 0,05 o menos se considerará estadísticamente significativo.

5. Plan/marco de tiempo de la investigación i. Plan de tiempo Q/año Acciones Q1 Preparación de los documentos oficiales para la recolección de muestras, recolección de datos y aprobación ética y cálculo del tamaño de la muestra para el control y los pacientes Q2 Recolección de muestras de pacientes con criterios seleccionados y separación del suero en alícuotas Q3 Continuar con las recolecciones de muestras y la separación de suero en alícuotas + Extracción de ARN de las muestras Q4 Recolección de muestras de control y Extracción de ARN Q1 Síntesis de ADNc para todas las muestras + qPCR Q2 Análisis estadístico de los datos y comienzo de redacción de un artículo + Colección de artículos relacionados para redacción de tesis Q3 Publicación de el trabajo y finalizar la tesis para su revisión

ii. Título del artículo: "La utilidad diagnóstica de los supresores tumorales o pequeños biomarcadores oncogénicos en asociación con LncRNA en el cáncer de mama"

Autores:

Marwa M. Mohamed, Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Autor correspondiente: Prof. Nadia M. Hamdy Primer autor: Marwa M. Mohamed Autor(es) colaborador(es): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

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