Marqueurs LINC00511/miR-185-3p Axis et miR-301a-3p pour le diagnostic du cancer du sein

1. Introduction 1.1. Contexte : Le cancer du sein est l'une des principales causes de décès chez les femmes dans le monde. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), le nombre de cas de cancer attendus en 2025 sera de 19,3 millions de cas. En Egypte, le cancer est un problème croissant et en particulier le cancer du sein [1].

   Le cancer du sein est la tumeur maligne féminine la plus courante et constitue une menace majeure pour la santé des femmes. Son développement se traduit par une invasion locale considérablement agressive, des métastases précoces et une multirésistance aux médicaments à la chimiothérapie [2, 3]. Par conséquent, le développement de marqueurs mini-invasifs pour la détection précoce du cancer du sein présente un grand intérêt.

   L'Atlas du génome du cancer (TCGA) a révélé que de nombreuses mutations et modifications du nombre de copies trouvées dans le cancer ne chevauchent pas les gènes codant pour les protéines [4], mais sont fréquemment localisées dans l'ADN non codant, y compris les gènes d'ARN non codants [5]. . Les microARN (miARN) ont été parmi les premiers ARN non codants à avoir été étudiés sur le cancer, ainsi que sur leur rôle en tant que cibles thérapeutiques ou biomarqueurs dans le cancer [6].

   Les miARN sont de courtes séquences d'ARN simple brin (généralement de 19 à 23 nucléotides) qui contrôlent l'expression des gènes dans divers processus physiologiques et développementaux, jouant ainsi un rôle essentiel dans la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes dans un large éventail de systèmes biologiques [7, 8]. Les miARN interviennent dans la répression de l'ARNm cible par appariement de bases à une séquence complémentaire dans le 3'-UTR, provoquant une déstabilisation du transcrit, une répression traductionnelle ou les deux [9]. Il a été rapporté que les miARN modulent également l'expression des gènes en se liant à d'autres régions, y compris les exons codant pour des protéines [10], et peuvent même induire l'expression des gènes dans les cellules de mammifères [11].

   Les miARN circulants acellulaires existent généralement liés à des complexes ribonucléoprotéiques ou à des lipoprotéines de haute densité ou ils sont libérés par les cellules dans des vésicules lipidiques, des micro-vésicules, des exosomes ou des corps apoptotiques [12-15]. Ainsi, les miARN circulants peuvent refléter la réponse homéostatique du organisme, ainsi que des signes de progression de la maladie. En raison de leur stabilité et de leur résistance à l’activité RNAse endogène, ces miARN ont été proposés comme biomarqueurs diagnostiques et pronostiques de maladies, notamment du cancer (16).

   Parmi ces miARN, MiR-185-3p a été identifié comme gène suppresseur de tumeur dans divers types de cancer. L'expression de miR-185-3p a été diminuée dans les cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 et MCF-7. De plus, miR-185-3p était surexprimé dans la transfection silencieuse LINC00511, alors qu'il diminuait dans la transfection plasmidique améliorée LINC00511 (17).

   Le microARN-301a est un autre oncomiR associé à la progression tumorale dans plusieurs types de cancer. Par exemple, dans le cancer de la prostate, le cancer gastrique ainsi que le cancer du pancréas [18-21]. Cependant, son rôle dans le cancer du sein n’a pas été entièrement étudié.

   Les ARN longs non codants (LncRNA) sont ceux qui dépassent 200 nucléotides, et beaucoup d’entre eux peuvent également servir de transcrits primaires pour produire des ARN courts. De manière générale, les LncRNA ont été impliqués dans des rôles de régulation des gènes, tels que la compensation du dosage de la chromatine, l'empreinte, la régulation épigénétique, le contrôle du cycle cellulaire, le trafic nucléaire et cytoplasmique et la différenciation cellulaire (22). En outre, l'interaction pré-ARNm où le transcrit primaire interagit avec les LncARN et se termine par une séquence épissée fonctionnelle différente ou est dégradée en petits ARN interférents endogènes, éponges miARN, modulation de l'activité protéique ou localisation et facilitation de la formation de complexes riboprotéiques. En aucun cas, les LncARN peuvent servir de précurseurs à des fragments plus petits comme les miARN ou les piARN. La fonction principale des ciARN consiste à capturer les miARN via des interactions complémentaires, fonctionnant comme une éponge à miARN (23). Les ARNlnc ont déjà été impliqués dans des maladies humaines, notamment le cancer (24).

   ARN intergénique non codant long 00511 (LINC00511) ; est un oncogène qui influence la taille de la tumeur, les métastases et le mauvais pronostic. LINC00511 se lie à l'histone méthyltransférase EZH2 et spécifie le modèle de modification de l'histone sur p57 [25]. Il agit également comme oncogène dans le carcinome épidermoïde et l'adénocarcinome canalaire pancréatique [26]. En particulier, on sait peu de choses si les LncRNA peuvent servir de biomarqueurs pour le pronostic ou le diagnostic du cancer. [27] 1.2. Problème : Le rôle de ces biomarqueurs n’a pas encore été étudié dans le diagnostic précoce du cancer du sein.

   1.3. Hypothèse : Suppresseur de tumeur ou biomarqueurs oncogènes et LncRNA utilisés dans le diagnostic précoce du cancer du sein »

2. Objectif du travail :

   L'objectif ultime du travail est de fournir une image plus claire des fonctions de miR-185-3p, miR-301a, en association avec LINC00511 dans le diagnostic précoce des tumeurs du sein en mesurant à la fois la sensibilité et la spécificité.

3. Résultats des études antérieures : en demi-page. Aucune étude clinique antérieure n'a été réalisée sur l'aspect des utilités diagnostiques des biomarqueurs étudiés.

4. Énoncé du problème :

   Le rôle de ces biomarqueurs n'a pas encore été étudié dans le diagnostic précoce du cancer du sein chez les patientes égyptiennes.

5. Importance de la recherche :

Résultat primaire:

• Pour identifier le cancer du sein suppresseur de tumeur circulant dans le sang périphérique ou les petits biomarqueurs oncogènes et comparer avec l'expression de contrôle normale.

Résultat secondaire :

• Calculer la sensibilité et la spécificité de miR-185-3p, miR-301a et LINC00511 par rapport aux marqueurs à base de protéines (CEA et CA15-3) comme marqueurs de diagnostic.

6. Objectifs de recherche :

1. Analysez le niveau d’expression de deux miARN (miR-185-3p, miR-301a) et leur ARNlnc interagi prédit (LINC00511) en tant que marqueurs moléculaires non invasifs minimaux pour le diagnostic du cancer du sein primitif.
2. Comparez miR-185-3p, miR-301a et LINC00511 avec les marqueurs à base de protéines (CEA et CA15-3) comme marqueurs de diagnostic, en ce qui concerne la sensibilité et la spécificité.
3. Étudiez la relation entre miR-185-3p, miR-301a et LINC00511 et les caractères clinicopathologiques du cancer du sein.
4. Méthodologie de recherche :

Cette étude sera d'abord approuvée par le comité d'éthique de la Faculté de pharmacie de l'Université Ain Shams et par le Comité d'éthique de l'Institut national du cancer du Nouveau Caire. De plus, il sera réalisé conformément aux directives de la Déclaration d'Helsinki, où deux groupes seront inclus et tous les sujets donneront leur consentement écrit pour être archivé.

Groupe 1, le groupe témoin : un total de 50 volontaires sains qui sont des femmes volontaires en bonne santé du même âge, ne souffrant d'aucune maladie et ne prenant aucun médicament.

Groupe 2 (Tumeur maligne du sein) : 50 femmes atteintes d'un cancer du sein primitif non métastatique Patientes récemment diagnostiquées qui n'ont pas encore reçu de chimiothérapie ou de radiothérapie, fréquentant l'Institut national du cancer du Nouveau Caire.

Un historique complet sera pris pour tous les cas et contrôles. Les caractéristiques des patientes atteintes d'un cancer du sein en ce qui concerne l'âge, l'état ménopausique, le type histopathologique, la taille de la tumeur, les métastases ganglionnaires et le grade de la tumeur, ainsi que le récepteur des œstrogènes (ER) et le récepteur de la progestérone (PR) seront collectés pour l'analyse des données.

Critère d'exclusion

Patients avec :

• Troubles sanguins, -Tout cancer autre que le cancer du sein
• Cirrhose du foie, maladies de l'utérus et de la vessie

Méthodes :

Travail de routine:

Prélèvement de sang :

5 ml de sang seront collectés dans des tubes vacutainer simples pour la préparation du sérum. Les échantillons de sérum seront conservés à -80 ºC jusqu'à l'évaluation biochimique au laboratoire de recherche du département de biochimie, Faculté de pharmacie, Université Ain Shams.

Dosage de miR-185-3p, miR-301a et LINC00511 par PCR quantitative :

Les miARN et les LncARN seront extraits du sérum à l'aide du mini kit Qiagen miRNeasy selon le protocole du fabricant et leur concentration et leur pureté seront détectées par un spectrophotomètre nanodrop.

L'ARN enrichi sera transcrit de manière inverse avec le kit de transcription inverse miroRNA ou LncRNAs selon le protocole du fabricant.

L'expression des miARN et des LncARN sera quantifiée par qRT-PCR à l'aide de kits de test de microARN et de LncARN humains et de leurs amorces spécifiques.

Les niveaux d'expression du miARN étudié seront évalués à l'aide de la méthode ∆Ct [28]. La valeur du seuil de cycle (Ct) est le nombre de cycles qPCR requis pour que le signal fluorescent franchisse un seuil spécifique. ∆Ct sera calculé en soustrayant les valeurs Ct de RNU6-2 et GAPDH de celles des miARN et LncARN étudiés, respectivement. Le ∆∆Ct sera calculé en soustrayant le ∆Ct des échantillons témoins du ∆Ct des échantillons de cancer.

Examen des récepteurs hormonaux et des marqueurs tumoraux à base de protéines : le récepteur des œstrogènes, le récepteur de la progestérone et le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER-2neu), en plus des marqueurs tumoraux CEA et CA15.3 utilisant des kits ELISA, seront obtenus auprès du National Cancer Institute. , Nouveau Caire.

ESTIMATION DE LA TAILLE DE L'ÉCHANTILLON Le but de cette étude est d'étudier le rôle de certains miARN circulants provenant de cas de contrôle indépendant et de cancer du sein avec 1 contrôle par sujet expérimental. Sur la base d'une étude précédente (Hu et al. 2012), l'expression des petits biomarqueurs oncogènes était normalement distribuée avec un écart type de 2,9 et une grande taille d'effet (1,09). Si la véritable différence entre les moyennes du groupe de cancer du sein et du groupe témoin est de 2,25, nous devrons étudier 25 sujets expérimentaux et 25 sujets témoins pour pouvoir rejeter l'hypothèse nulle selon laquelle les moyennes de population des groupes expérimental et témoin sont égales avec probabilité ( puissance) 0,8. La probabilité d'erreur de type I associée à ce test de cette hypothèse nulle est de 0,05.

En ce qui concerne les moyens d'expression du suppresseur de tumeur, ils étaient normalement distribués avec une taille d'effet importante (1,4). Si la véritable différence entre les moyennes du groupe du cancer du sein et du groupe témoin est de 14, nous devrons étudier 15 sujets expérimentaux et 15 sujets témoins pour pouvoir rejeter l'hypothèse nulle selon laquelle les moyennes de population des groupes expérimental et témoin sont égales avec probabilité ( puissance) 0,8. La probabilité d'erreur de type I associée à ce test de cette hypothèse nulle est de 0,05.

La taille totale de l'échantillon sera de 80 cas, ce nombre sera augmenté de 25 % pour les pertes attendues, et l'échantillon total est de 100 sujets, 50 sujets par groupe.

L'estimation de la taille de l'échantillon a été réalisée à l'aide du calculateur de taille d'échantillon G power*.

Analyses statistiques:

Le progiciel SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL) sera utilisé pour effectuer les analyses statistiques. Le test T ou le test U de Mann-Whitney sera utilisé pour comparer la différence des variables continues dans deux groupes, selon le cas. L'analyse du chi carré de Pearson ou le test exact de Fisher seront utilisés pour comparer la différence des variables catégorielles. La courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) et l'aire sous la courbe ROC (AUC) seront tracées pour déterminer le meilleur seuil qui fait la distinction entre les groupes cancéreux et non cancéreux ; les sensibilités et spécificités seront calculées pour les miARN et leur efficacité diagnostique. Pour toutes les analyses, une valeur P bilatérale de 0,05 ou moins sera considérée comme statistiquement significative.

5. Plan/cadre de recherche i. Calendrier Q/année Actions Q1 Préparation des documents officiels pour la collecte d'échantillons, la collecte de données et l'approbation éthique et calcul de la taille de l'échantillon pour le contrôle et les patients Q2 Prélèvement d'échantillons auprès de patients avec des critères sélectionnés et séparation du sérum en aliquotes Q3 Poursuivre les prélèvements d'échantillons et la séparation des sérum en aliquotes + Extraction des ARN des échantillons Q4 Collecte des échantillons de contrôle et Extraction des ARN Q1 Synthèse de l'ADNc pour tous les échantillons + qPCR Q2 Analyse statistique des données et début de la rédaction d'un article + collection d'articles connexes pour la rédaction de la thèse Q3 Publication de l'article et finaliser la thèse pour révision

ii. Titre de l'article : « L'utilité diagnostique du suppresseur de tumeur ou des petits biomarqueurs oncogènes en association avec l'ARNLnc dans le cancer du sein »

Auteurs:

Marwa M. Mohamed, Dr Eman Fouad Sanad, Dr Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Auteur correspondant : Prof. Nadia M. Hamdy Premier auteur : Marwa M. Mohamed Auteur(s) collaborateur(s) : Dr Eman Fouad Sanad, Dr Reham Ali Abbas El-Shimy

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