LINC00511/miR-185-3p Axis- en miR-301a-3p-markers voor de diagnose van borstkanker

1. Inleiding 1.1. Achtergrond: Borstkanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken voor vrouwen. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) zal het verwachte aantal gevallen van kanker in 2025 19,3 miljoen gevallen bedragen. In Egypte is kanker een steeds groter probleem, en dan vooral borstkanker [1].

   Borstkanker is de meest voorkomende kwaadaardige tumor bij vrouwen en een grote bedreiging voor de gezondheid van vrouwen. De ontwikkeling ervan bestaat uit een aanzienlijk agressieve lokale invasie, vroege metastasen en resistentie tegen meerdere geneesmiddelen tegen chemotherapie [2, 3]. Daarom zijn de ontwikkelingen van minimaal invasieve markers voor de vroege detectie van borstkanker van groot belang.

   De kankergenoomatlas (TCGA) onthulde dat veel van de mutaties en veranderingen in het aantal kopieën die bij kanker worden aangetroffen, niet overlappen met eiwitcoderende genen [4], maar vaak gelokaliseerd zijn in niet-coderend DNA, inclusief niet-coderende RNA-genen [5]. . MicroRNA’s (miRNA’s) behoorden tot de eerste niet-coderende RNA’s die onderzoek deden naar kanker, en hun rol als therapeutische doelwitten of biomarkers bij kanker [6].

   MiRNA’s zijn korte, enkelstrengige RNA-sequenties (meestal 19-23 nucleotiden) die genexpressie controleren in een verscheidenheid aan fysiologische en ontwikkelingsprocessen, en dus een cruciale rol spelen in de posttranscriptionele regulatie van genexpressie in een breed scala aan biologische systemen [7, 8]. MiRNA's mediëren de repressie van doel-mRNA door basenparing met complementaire sequentie in de 3'-UTR, waardoor transcriptiedestabilisatie, translationele repressie of beide worden veroorzaakt [9]. Er is gerapporteerd dat miRNA’s ook genexpressie moduleren door zich te binden aan andere regio’s, waaronder eiwitcoderende exons [10], en zelfs genexpressie in zoogdiercellen kunnen induceren [11].

   Celvrije circulerende miRNA’s zijn meestal gebonden aan ribonucleoprotiencomplexen of lipoproteïnen met hoge dichtheid, of ze worden vrijgegeven uit cellen in lipideblaasjes, microblaasjes, exosomen of apoptotische lichamen [12-15]. Circulerende miRNA’s kunnen dus de homeostatische respons van het lichaam weerspiegelen. organisme, evenals tekenen van ziekteprogressie. Vanwege hun stabiliteit en weerstand tegen endogene RNAse-activiteit zijn deze miRNA's voorgesteld als diagnostische en prognostische biomarkers voor ziekten, waaronder kanker [16].

   Van deze miRNA's is MiR-185-3p geïdentificeerd als een tumorsuppressorgen bij verschillende soorten kanker. De expressie van miR-185-3p was verlaagd in borstkankercellen MDA-MB-231 en MCF-7. Bovendien werd miR-185-3p tot overexpressie gebracht in de LINC00511-stilgelegde transfectie, terwijl het afnam in de verbeterdeLINC00511-plasmidetransfectie [17].

   MicroRNA-301a is een andere oncomiR die in verband is gebracht met tumorprogressie bij verschillende soorten kanker. Bijvoorbeeld bij prostaatkanker, maagkanker en pancreaskanker [18-21]. De rol ervan bij borstkanker is echter nog niet volledig onderzocht.

   Lange niet-coderende RNA's (LncRNA's) zijn RNA's die langer zijn dan 200 nucleotiden, en veel ervan kunnen ook fungeren als primaire transcripten om korte RNA's te produceren. Over het algemeen zijn LncRNA's betrokken bij genregulerende rollen, zoals compensatie van de chromatinedosering, imprinting, epigenetische regulatie, controle van de celcyclus, nucleaire en cytoplasmatische handel en celdifferentiatie [22]. Verder pre-mRNA-interactie waarbij het primaire transcript een interactie aangaat met LncRNA's en eindigt met een andere functionele gesplitste sequentie of wordt afgebroken tot endogene kleine interfererende RNA's, miRNA-sponzen, modulatie van eiwitactiviteit of lokalisatie en facilitering van de vorming van riboproteïnecomplexen. Niet in de laatste plaats kunnen LncRNA's als voorlopers dienen voor kleinere fragmenten zoals miRNA's of piRNA's. De belangrijkste functie van ciRNA's bestaat uit het vastleggen van miRNA's door middel van complementaire interacties, en functioneert als een miRNA-spons [23]. LncRNA's zijn al betrokken bij ziekten bij de mens, waaronder kanker [24].

   Lang intergeen niet-coderend RNA 00511 (LINC00511); is een oncogen dat de tumorgrootte, metastase en slechte prognose beïnvloedt. LINC00511 bindt histonmethyltransferase EZH2 en specificeert het histonmodificatiepatroon op p57 [25]. Het werkt ook als een oncogen bij plaveiselcelcarcinoom en ductaal adenocarcinoom van de pancreas [26]. Er is met name weinig bekend of LncRNA's kunnen dienen als biomarkers voor de prognose of diagnose van kanker. [27] 1.2. Probleem: De rol van deze biomarkers bij de vroege diagnose van borstkanker is nog niet onderzocht.

   1.3. Hypothese: Tumorsuppressor of oncogene biomarkers en LncRNA gebruikt bij vroege diagnose van borstkanker"

2. Doel van het werk:

   Het uiteindelijke doel van het werk is om een ​​duidelijker beeld te geven van de functies van miR-185-3p, miR-301a, in samenwerking met LINC00511 bij de vroege diagnose van borsttumoren, waarbij zowel de gevoeligheid als de specificiteit worden gemeten.

3. Resultaten van eerdere onderzoeken: op een halve pagina. Er zijn geen eerdere klinische onderzoeken uitgevoerd naar het aspect van de diagnostische bruikbaarheid van de bestudeerde biomarkers.

4. Probleemstelling:

   De rol van deze biomarkers bij de vroege diagnose van borstkanker bij Egyptische patiënten is nog niet onderzocht.

5. Onderzoeksbelang:

Primaire uitkomst:

• Om perifere bloedcirculerende tumoronderdrukkers of oncogene kleine biomarkers borstkanker te identificeren en te vergelijken met normale controle-expressie

Secundaire uitkomst:

• Om de gevoeligheid en specificiteit van miR-185-3p, miR-301a en LINC00511 te berekenen in vergelijking met de op eiwitten gebaseerde markers (CEA en CA15-3) als diagnostische markers.

6. Onderzoeksdoelstellingen:

1. Analyseer het expressieniveau van twee miRNA (miR-185-3p, miR-301a) en hun voorspelde interactie lncRNA (LINC00511) als minimale niet-invasieve moleculaire markers voor het diagnosticeren van de primaire borstkanker.
2. Vergelijk miR-185-3p, miR-301a en LINC00511 met de op eiwit gebaseerde markers (CEA en CA15-3) als diagnostische markers, met betrekking tot gevoeligheid en specificiteit.
3. Bestudeer de relatie tussen miR-185-3p, miR-301a en LINC00511 en de klinisch-pathologische kenmerken van borstkanker.
4. Onderzoeksmethode:

Deze studie zal eerst worden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit Farmacie, Ain Shams University en door de Ethische Commissie van het National Cancer Institute, New Cairo. Bovendien zal het worden uitgevoerd in overeenstemming met de Declaration of Helsinki Guidelines, waarbij twee groepen zullen worden opgenomen en alle proefpersonen hun schriftelijke toestemming zullen geven om te worden gearchiveerd.

Groep 1, de controlegroep: in totaal 50 gezonde vrijwilligers, gezonde vrouwelijke vrijwilligers die qua leeftijd overeenkomen en niet aan enige ziekte lijden en geen medicijnen gebruiken.

Groep 2 (kwaadaardige borsttumor): 50 vrouwen met niet-gemetastaseerde primaire borstkanker Recentelijk gediagnosticeerde patiënten die nog geen chemotherapie of radiotherapie hebben gekregen en die naar het National Cancer Institute, New Cairo gaan.

Van alle gevallen en controles wordt de volledige geschiedenis afgenomen. De kenmerken van de borstkankerpatiënten met betrekking tot leeftijd, menopauzestatus, histopathologisch type, tumorgrootte, lymfekliermetastasen en tumorgraad, evenals oestrogeenreceptor (ER) en progesteronreceptor (PR) zullen worden verzameld voor data-analyse.

Uitsluitingscriteria

Patiënten met:

• Bloedziekteziekten, -Elke vorm van kanker, behalve borstkanker
• Levercirrose, baarmoeder- en urineblaasziekten

Methoden:

Routine werk:

Bloedafname:

Er wordt 5 ml bloed verzameld in gewone vacutainerbuisjes voor serumbereiding. Serummonsters zullen bij -80 ºC worden bewaard tot biochemische beoordeling in het Biochemistry Department Research Lab, Faculteit Farmacie, Ain Shams University.

Test van miR-185-3p, miR-301a en LINC00511 door kwantitatieve PCR:

MiRNA en LncRNA's zullen uit serum worden geëxtraheerd met behulp van de Qiagen miRNeasy Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant en hun concentratie en zuiverheid zullen worden gedetecteerd met behulp van een nanodrop-spectrofotometer.

Verrijkt RNA zal omgekeerd worden getranscribeerd met miroRNA of LncRNAs reverse transcriptiekit volgens het protocol van de fabrikant.

De expressie van miRNA en LncRNAs zal worden gekwantificeerd door qRT-PCR met behulp van menselijke MicroRNA- en LncRNAs-testkits en hun specifieke primers.

De expressieniveaus van het onderzochte miRNA zullen worden geëvalueerd met behulp van de ∆Ct-methode [28]. De cyclusdrempelwaarde (Ct) is het aantal qPCR-cycli dat nodig is voordat het fluorescentiesignaal een specifieke drempel overschrijdt. ∆Ct zal worden berekend door de Ct-waarden van RNU6-2 en GAPDH af te trekken van die van respectievelijk de onderzochte miRNA's en LncRNA's. De ∆∆Ct wordt berekend door de ∆Ct van de controlemonsters af te trekken van de ∆Ct van de kankermonsters.

Onderzoek van hormoonreceptoren en op eiwitten gebaseerde tumormarkers: Zowel de oestrogeenreceptor, de progesteronreceptor als de humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER-2neu), naast CEA- en CA15.3-tumormarkers, zullen met behulp van ELISA-kits worden verkregen van het National Cancer Institute , Nieuw Caïro.

SCHATTING VAN DE STEEKPROEFOMvang Het doel van deze studie is om de rol te onderzoeken van enkele circulerende MiRNA's uit onafhankelijke controle- en borstkankergevallen met 1 controle per proefpersoon. Op basis van eerder onderzoek (Hu et al. 2012) was de expressie van oncogene kleine biomarkers normaal verdeeld met een standaardafwijking van 2,9 en een grote effectgrootte (1,09). Als het werkelijke verschil tussen de gemiddelden van de borstkankergroep en de controlegroep 2,25 is, zullen we 25 proefpersonen en 25 controlepersonen moeten bestuderen om de nulhypothese te kunnen verwerpen dat de populatiegemiddelden van de experimentele en de controlegroep gelijk zijn aan de waarschijnlijkheid ( vermogen) 0,8. De kans op een Type I-fout die bij deze toetsing van deze nulhypothese hoort, bedraagt ​​0,05.

Wat betreft de tumorsuppressor waren de expressiegemiddelden normaal verdeeld met een grote effectgrootte (1,4). Als het werkelijke verschil tussen de gemiddelden van de borstkankergroep en de controlegroep 14 bedraagt, zullen we 15 proefpersonen en 15 controlepersonen moeten bestuderen om de nulhypothese te kunnen verwerpen dat de populatiegemiddelden van de experimentele en de controlegroep gelijk zijn aan de waarschijnlijkheid ( vermogen) 0,8. De kans op een Type I-fout die bij deze toetsing van deze nulhypothese hoort, bedraagt ​​0,05.

De totale steekproefomvang zal 80 gevallen bedragen, dit aantal zal met 25% worden verhoogd vanwege verwachte verliezen, en de totale steekproef zal 100 proefpersonen bedragen, 50 proefpersonen per groep.

De schatting van de steekproefomvang werd uitgevoerd met de G power* steekproefomvangcalculator.

Statistische analyse:

SPSS 21.0 softwarepakket (SPSS,Chicago,IL) zal worden gebruikt om de statistische analyses uit te voeren. De T-test of Mann-Whitney's U-test zal worden gebruikt om, indien van toepassing, het verschil tussen continue variabelen in twee groepen te vergelijken. Pearson's Chi-kwadraatanalyse of Fisher's exact-test zullen worden gebruikt om het verschil tussen categorische variabelen te vergelijken. Ontvanger-bedrijfskarakteristiek (ROC)-curve en gebied onder de ROC-curve (AUC) zullen worden uitgezet om het beste grenspunt te bepalen dat onderscheid maakt tussen kanker- en niet-kankergroepen; de gevoeligheden en specificiteiten zullen worden berekend voor de miRNA's en hun diagnostische effectiviteit. Voor alle analyses zal een tweezijdige P-waarde van 0,05 of minder als statistisch significant worden beschouwd.

5. Onderzoekstijdplan/-kader i. Tijdsplan Q/jaar Acties Q1 Voorbereiding van de officiële documenten voor monsterafname, gegevensverzameling en ethische goedkeuring en berekening van de monstergrootte voor controlegroep en patiënten Q2 Monsterafname van patiënten met geselecteerde criteria en scheiding van serum in aliquots Q3 Doorgaan met monsterafname en scheiding van serum in aliquots + Extractie van RNA uit de monsters Q4 Verzameling van controlemonsters en extractie van RNA Q1 cDNA-synthese voor alle monsters + qPCR Q2 Statistische analyse van de gegevens en beginnen met het schrijven van een paper + verzameling van gerelateerde artikelen voor het schrijven van scripties Q3 Publicatie van het artikel en het finaliseren van het proefschrift voor herziening

ii. Titel van het artikel: "Het diagnostische nut van tumoronderdrukkers of oncogene kleine biomarkers in associatie met LncRNA bij borstkanker"

Auteurs:

Marwa M. Mohamed, dr. Eman Fouad Sanad, dr. Reham Ali Abbas El-Shimy, Nadia M. Hamdy.

Corresponderende auteur: Prof. Nadia M. Hamdy Eerste auteur: Marwa M. Mohamed Bijdragende auteur(s): Dr. Eman Fouad Sanad, Dr. Reham Ali Abbas El-Shimy

6. Referentielijst:

1. D. A. Ragab, M. Sharkas, S. Marshall en J. Reen, "Borstkankerdetectie met behulp van diepe convolutionele neurale netwerken en ondersteunende vectormachines", PeerJ, vol. 7, blz. e6201, 2019.
2. A.E. Cyr en J.A.Margenthaler, "Moleculaire profilering van borstkanker", "Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 23, nee. 3. blz. 451-462, 2014.
3. W. J. Gradishar, ‘Treatment of metastatic breast cancer,’ in JNCCN Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2014, vol. 12, nee. 5 SUPPL., blz. 759-761.
4. H.L. Martin, L. Smith en D.C. Tomlinson, "Multidrug-resistente borstkanker: huidige perspectieven", "Breast Cancer: Targets and Therapy, vol. 6, nee. 0. Pp. 1-13, 2014.
5. S. Nik-Zainal et al., "Landschap van somatische mutaties in 560 volledige genoomsequenties van borstkanker", "Nature, vol. 534, nee. 7605, blz. 47-54, 2016.
6. M.T. Maurano et al., "Systematische lokalisatie van veelvoorkomende ziekte-geassocieerde variatie in regulerend DNA", Science (80-.), vol. 337, nee. 6099, blz. 1190-1195, 2012.
7. MV Iorio en CM Croce, "MicroRNA-ontregeling bij kanker: diagnostiek, monitoring en therapieën. Een uitgebreid overzicht, "EMBO Molecular Medicine, vol. 4, nee. 3. blz. 143-159, 2012.
8. D. Baek, J. Villen, C. Shin, F.D. Camargo, S.P. Gygi en D.P. Bartel, "De impact van microRNA's op de eiwitproductie", Nature, vol. 7209, blz. 64-71, 2008.
9. L.P. Lim et al., "Microarray-analyse laat zien dat sommige microRNA's grote aantallen doel-mRNA's downreguleren", Nature, vol. 433, nee. 7027, blz. 769-773, 2005.
10. W. Filipowicz, SN Bhattacharyya en N. Sonenberg, "Mechanismen van post-transcriptionele regulatie door microRNA's: zijn de antwoorden in zicht?" Nature Beoordelingen Genetica, vol. 9, nee. 2. blz. 102-114, 2008.
11. J. J. Forman, A. Legesse-Miller en H. A. Coller, "Een zoektocht naar geconserveerde sequenties in coderende regio's onthult dat het let-7 microRNA zich richt op Dicer binnen zijn coderende sequentie", "Proc. Nat. Acad. Wetenschap, vol. 105, nee. 39, blz. 14879-14884, 2008.
12. S. Vasudevan, Y. Tong en J.A. Steitz, "Overschakelen van repressie naar activering: microRNA's kunnen de vertaling opwaarts reguleren", Science (80-.), vol. 318, nee. 5858, blz. 1931-1934, 2007.
13. KC Vickers, B.T. Palmisano, B.M. Shoucri, R.D. Shamburek en A.T. Remaley, "MicroRNA's worden in plasma getransporteerd en afgeleverd aan ontvangende cellen door lipoproteïnen met een hoge dichtheid", Nat. Celbiol., vol. 13, nee. 4, blz. 423-435, 2011.
14. H. Valadi, K. Ekstrom, A. Bossios, M. Sjostrand, JJ Lee en J. O. Lotvall, "Exosome-gemedieerde overdracht van mRNA en microRNA's is een nieuw mechanisme van genatische uitwisseling tussen cellen., "Nat. Celbiol., vol. 9, nee. 6, blz. 654-9, 2007.
15. J. L. Lindenberg et al., "Funcionele levering van virale miRNA's via exosomen, "Proc. Nat. Acad. Wetenschap, vol. 107, nee. 14, blz. 6328-6333, 2010.
16. A. Turchinovich, L. Weiz en B. Burwinkel, "Extracellulaire miRNA's: het mysterie van hun oorsprong en functie", Trends Biochem. Wetenschap, vol. 37, nee. 11, blz. 460-465, 2012.
17. L. J. Chin en F. J. Slack, "Een waarheidsserum voor kanker ---- microRNA's hebben een groot potentieel als biomarkers voor kanker", Cell Res., vol. 18, nee. 10, blz. 983-984, 2008.
18. Lu et al., "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research" (2018)
19. Cui, L. et al. Expressie van MicroRNA-301a en zijn functionele rollen bij kwaadaardig melanoom. Cellulaire fysiologie en biochemie: internationaal tijdschrift voor experimentele cellulaire fysiologie, biochemie en farmacologie 40, 230-244, (2016).
20. Shi, Y.K., Zang, Q.L., Li, G.X., Huang, Y. & Wang, S.Z. Verhoogde expressie van microRNA-301a bij niet-kleincellige longkanker en de klinische betekenis ervan. Tijdschrift voor kankeronderzoek en therapieën 12, 693-698, (2016).
21. Chen, Z. et al. miR-301a bevordert de proliferatie van pancreaskankercellen door de Bim-expressie direct te remmen. Journal of cellulaire biochemie 113, 3229-3235, (2012).
22. Ma, X. et al. Modulatie van tumorigenese door het pro-inflammatoire microRNA miR-301a in muismodellen van longkanker en colorectale kanker. Celontdekking 1, 15005, (2015).
23. O. Wapinski en H. Y. Chang, "Lange niet-coderende RNA's en menselijke ziekten", Trends in Cell Biology, vol. 21, nr.6. blz. 354-361, 2011.
24. D. Gulei, N. Mehterov, S. M. Nabavi, AG Atanasov en I. Berindan-Neagoe, "Targeting ncRNA's door secundaire metabolieten van planten: het ncRNA'sspel is in balans richting remming van maligniteiten", "Biotechnology Advances, vol. 36, nee. 6. blz. 1779-1799, 2018.
25. T. Derrien, R. Guigo en R. Johnson, "De lange niet-coderende RNA's: een nieuwe (p) laag in de 'donkere materie', 'Frontiers in Genetics, vol. 2, nee. Januari 2012.
26. Ding J, Yang C, Yang S. LINC00511 werkt samen met miR-765 en moduleert de progressie van plaveiselcelcarcinoom van de tong door zich te richten op LAMC2. J Orale Pathol Med. 2018;47:46876.
27. Zhao X, Liu Y, Li Z, Zheng S, Wang Z, Li W, Bi Z, Li L, Jiang Y, Luo Y, Lin Q, Fu Z, Rufu C. Linc00511 fungeert als een concurrerend endogeen RNA om VEGFA-expressie te reguleren door het sponzen van hsa-miR-29b-3p bij ductaal adenocarcinoom van de pancreas. J Cell Mol Med. 2018;22:655-67
28. S. H. Kim et al., "Correlatie van echografieresultaten met histologie, tumorgraad en biologische markers bij borstkanker", ActaOncol. (Madar)., vol. 47, nee. 8, blz. 1531-1538, 2008.
29. M. H. Zweig en G. Campbell, "Receiver-operating karakteristieke (ROC) plots: een fundamenteel evaluatie-instrument in de klinische geneeskunde", "Clinical Chemistry, vol. 39, nee. 4. blz. 561-577, 1993.

(30)Hu, Z. B., J. Dong, L.E. Wang, H. X. Ma, J. B. Liu, Y. Zhao, J. H. Tang, X. Chen, J. C. Dai, Q. Y. Wei, C. Y. Zhang & H. B. Shen (2012) SerummicroRNA-profilering en borstonderzoek kankerrisico: het gebruik van miR-484/191 als endogene controles. Carcinogenese, 33, 828-834.