頭蓋顔面疾患の治療のために生体分子を届ける機能性バイオインク (DART-CRAFT)

成型可能な生合成コラーゲンベースのポリマーマトリックスを開発するには、市販のゼラチンメタクリルアミド（GelMA）ベースのヒドロゲルを生化学的に修飾して擬似塑性と降伏応力を微調整し、生物学的特性を改善するための薬物送達を実現するために機能化します。 GelMA には次の物質が化学的に豊富に含まれます: 接着分子 (例: 必要に応じて、頭蓋顔面再建に使用される移植可能材料への接着性を高めるために、アルギン酸塩ベースまたはイオン放出性無機化合物）、チオールベースの非開裂型光開始剤（例: エオシンYをトリエタノールアミンおよびビニルカプロラクタムと組み合わせて可視光活性化架橋を可能にし、紫外線の安全性への懸念を最小限に抑えます。 光架橋は、ポータブル可視光デバイス (420 ～ 480 nm) を通じて行われ、バイオインクのゼリー化を引き起こします。 さまざまな GelMA 化合物の物理的特性 (形態、粘弾性特性、剛性、加えられた応力に対する耐性) は、標準化された手順に従って分析されます。 GelMA の接着特性は、乾燥状態での重ねせん断強度試験によって測定されます。 最も高い生物学的特徴を示す GelMA 化合物が特定されると、これに官能化ポリ (乳酸-グリコール酸共重合体) (PLGA) ベースのナノ粒子 (NP) が付与されます。

この目的のために、生体適合性のPLGA-ポリエチレングリコール（PEG）NPが合成され、表面上の標的部分に結合するためにビススルホンで官能化されます。 合成には、PLGA 活性化、PLGA-PEG 結合、ビス-スルホン活性化、および PLGA-PEG-ビス-スルホン結合が含まれます。 PLGA/PEG 比は、疎水性/親水性ペイロードに合わせて調整されます。 ビススルホンは、タンパク質のジスルフィド結合の選択的かつ効率的なPEG化、または標準化された方法に従ってHisタグ付きタンパク質/ペプチドを結合させ、特定の細胞標的化または抗菌剤のいずれかを実行するために使用されます。 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) は、生合成反応を検証するために使用されます。 動的光散乱 (DLS)、ナノ粒子追跡分析 (NTA)、および走査型電子顕微鏡 (SEM) により、最終構造の形態学的特性と超微細構造特性が定義されます。 表面プラズモン共鳴はターゲット認識を検証します。 その後、GelMA-NP ハイブリッド複合アセンブリは、標準化された生産パイプラインに従って押出 3D プリンティングによって実現されます。 ヒドロゲルと NP 懸濁液は、圧力と温度の制御下で、個別のノズルを通じて 100 ～ 1000 nm のフィーチャ サイズの 2D および 3D パターンで塗布されます。 スカラー NP 濃度が使用され、評価されます。

NPの完全性とGelMAからのこれらの放出動態は、蛍光化合物をロードしたGelMA-NPを生体模倣細胞増殖培地に浸し、時間経過実験で上清中に放出されたNPを定量することによって研究されます。 NP の定量化は、UV-Vis 分光法、蛍光分光法、または NTA システムなどの粒子計数を使用して実行されます。 NP の完全性は、透過型電子顕微鏡 (TEM) と DLS を使用して研究されます。

GelMA-NP が生化学的に特徴付けられると、これらは、後述するプロテオミクス データを通じて同定された生理活性化合物を送達するために使用されます。

開発されたバイオインクを in vitro 頭蓋顔面疾患モデルで検証するために、頭蓋手術を受ける頭蓋顔面奇形患者が選択され、研究に登録されます。 具体的には、頭蓋骨癒合症やその他の先天異常、外傷、脳腫瘍を患い、頭蓋手術を受けている小児患者が登録されます。 頭蓋顔面手術を受ける成人患者も、頭蓋顔面外傷および腫瘍のために選択され、登録されます。 この目的のために、小児患者と成人患者の両方に由来する頭蓋骨組織標本は、署名されたインフォームドコンセント（子供の場合は両親による）を得た上で、頭蓋切除術または頭蓋円蓋改造中に手術廃棄物として取得されます。 各患者について、廃棄組織はランダムに 3 つのアリコートに分けられます。 これらのうち、1 アリコートを細胞増殖培地に収集し、骨組織サンプルを培養プレートに播種して間葉系間質細胞 (MSC) を単離します。 その後、MSC は 3 回目の培養継代まで拡大され、以下に示すように、関連する匿名化された臨床データとその後の分析のために最適化された追跡システムとともにバイオバンキング インフラストラクチャに収集されます。 GelMA ベースのバイオインク NP の放出と生体適合性は、接着斑の動態を評価し、免疫蛍光アッセイによるゲル化バイオインクへの細胞接着を研究するための機能アッセイを通じて、MSC を使用して分析されます。 細胞の挙動と生存率は、生細胞イメージング システム (Incucyte Live Cells Analysis システム) を使用した経時的実験で測定されます。

さらに、患者由来の骨組織標本 2 つのアリコートを液体窒素中で瞬間凍結します (プロテアーゼ阻害剤を含む凍結保護培地に浸した後)。 タンパク質と代謝産物は、社内の標準化されたプロトコルを使用してこれらのサンプルから単離されます。 抽出されたサンプルは、フィルター支援サンプル前処理 (FASP) 消化プロトコルを使用して消化されます。 次に、サンプルは液体クロマトグラフィー タンデム質量分析 (LC-MS/MS) によって分析されます。 また、代謝物は LC-MS/MS によって評価され、HPLC によって分離されます。 次に、タンパク質と代謝産物について得られた結果を統合パスウェイ解析 (IPA を使用) によって分析して、各患者のマルチオミック プロファイリングを達成し、創薬設計に利用する創薬可能な標的を特定します。 分子ドッキングや仮想スクリーニングを含むコンピューターによる薬剤設計ツールは、統合されたオミックプロファイルデータセットから選択された標的と相互作用できる薬剤/化学データベースからリード化合物を特定するために使用されます。 標的-リガンド複合体の動的挙動、安定性、結合相互作用は、分子動力学（MD）シミュレーションを通じて研究され、結合モチーフとホットスポットが分析されます。 分子相互作用に関する医学博士の情報に基づいた洞察は、新規化合物の設計と最適化を導きます。 これには、リガンドベースのアプローチによる構造修飾の組み込み、結合親和性、選択性、および薬物らしさを強化するための仮想スクリーニングの実行が含まれます。 これらのインシリコ研究を通じて特定された生体分子は、商業的に購入され、PLGA NP にカプセル化されます。 この点において、疎水性ペイロードにはナノ沈殿とシングルエマルションが利用され、親水性ペイロードにはダブルエマルション溶媒蒸発技術 (w1/o/w2) が利用されます。 その後、選択した化合物を送達する PLGA がヒドロゲル (GelMA) マトリックスに複合化されます。 生体分子を送達するバイオインク化合物の機能的な栄養特性と再生促進特性は、ALP 活性アッセイ、in vitro 石灰化染色、およびマーカー遺伝子発現解析を通じて、骨形成特性をテストするために MSC で評価されます。 さらに、ヒト臍帯静脈内皮細胞（商用ライン）は、インビトロで形成された毛細血管様構造を数えてサイジングすることによって血管新生特性を評価するために、GelMA-NPs-薬物複合体で処理されます（管形成アッセイ）。

さらに、定期的な臨床検査で末梢静脈血の少量のアリコート (小児患者の場合は 2 ～ 3 ml、成人患者の場合は最大 7 ml) が収集されます。 PBMC は、Ficoll 密度勾配遠心分離技術を使用して全血サンプルから分離されます。 次に、単球/マクロファージ細胞は、CD14 抗体結合磁気ビーズによって分離され、因子 (つまり、in vitro) とともに培養されます。 M-CSF、RANKL）成熟した破骨細胞を形成します。 これらは、GelMA-NP 化合物の生体吸収性を評価するために使用されます。 簡単に説明すると、破骨細胞は GelMA-NP ナノパターン表面に播種され、典型的な破骨細胞特異的マーカーの発現が免疫蛍光分析によって評価されます。 SEM と免疫蛍光アッセイを使用して、破骨細胞とバイオインクの界面を超構造的に視覚化し、吸収を 2 次元および 3 次元で識別します。

患者由来のMSC/骨前駆細胞および破骨細胞も、開発されたバイオインク複合体の検証のために、骨とインプラントの境界に存在する生物学的微環境を模倣する2Dおよび3Dのin vitro培養物を得るために利用されます。 バイオインクのコンポーネントは、各テストの目的に応じて、細胞（つまり、独立したノズルを通じて送達される細胞）をバイオプリントして細胞を含むモデルを形成するか、細胞培養容器の増殖表面にプリントして細胞播種前にゼリー化します。 GelMA からの NP の放出動態、細胞の生存率と増殖、血管新生と骨の再生効果が上記のように評価されます。

その抗菌効果をテストするために、アンロードされた GelMA と GelMA-NP の両方をペトリ皿に印刷し、ゼリー化させます。 その後、日和見細菌株 (E. 大腸菌、黄色ブドウ球菌、ミュータンス連鎖球菌、フェカリス菌、緑膿菌）を適切な培養液中で一晩培養します。 細菌の付着と数を比較評価し、用量と時間に関連した影響をテストします。 GelMA を上回る GelMA-NP の抗菌活性は、SEM イメージングによっても裏付けられます。