Bioink funzionalizzato che fornisce biomolecole per il trattamento delle malattie craniofacciali (DART-CRAFT)

Per sviluppare una matrice polimerica biosintetica modellabile a base di collagene, gli idrogel commerciali a base di gelatina-metacrilammide (GelMA) saranno modificati biochimicamente per ottimizzare la loro pseudoplasticità e lo stress da snervamento e funzionalizzati per implementare la somministrazione di farmaci per migliorare le proprietà biologiche. Il GelMA sarà arricchito chimicamente con: molecole adesive (es. composti inorganici a base di alginati o a rilascio di ioni), se necessario, per aumentare l'adesione ai materiali impiantabili utilizzati nella ricostruzione craniofacciale, fotoiniziatori non di tipo clivaggio a base tiolica (es. eosina combinata con trietanolammina e vinil caprolattame) per consentire la reticolazione attivata dalla luce visibile e ridurre al minimo i problemi di sicurezza della luce UV. La fotoreticolazione sarà ottenuta mediante un dispositivo portatile a luce visibile (420-480 nm) per indurre la gelificazione del bioinchiostro. Le proprietà fisiche (morfologia, proprietà viscoelastiche, rigidità, resistenza ad uno stress applicato) dei diversi composti GelMA saranno analizzate secondo procedure standardizzate. Le proprietà adesive del GelMA saranno misurate mediante test di resistenza al taglio in condizioni asciutte. Una volta identificati i composti GelMA che mostrano le più elevate caratteristiche biologiche, questo sarà dotato di nanoparticelle (NP) funzionalizzate a base di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA).

A questo scopo, le NP biocompatibili PLGA-polietilenglicole (PEG) saranno sintetizzate e funzionalizzate con bis-sulfone per legare le porzioni bersaglio sulla superficie. La sintesi prevede l'attivazione del PLGA, la coniugazione PLGA-PEG, l'attivazione del bis-solfone e la coniugazione PLGA-PEG-bis-sulfone. Il rapporto PLGA/PEG verrà regolato in base al carico utile di idrofobicità/idrofilicità. Il bis-sulfone viene utilizzato per la PEGilazione selettiva ed efficiente del legame disolfuro delle proteine ​​o per coniugare proteine/peptidi marcati con His secondo metodi standardizzati per implementare il targeting cellulare specifico o agenti antimicrobici. Per validare la reazione biosintetica verrà utilizzata la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). La diffusione dinamica della luce (DLS), l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e la microscopia elettronica a scansione (SEM) definiranno le proprietà morfologiche e ultrastrutturali del costrutto finale. La risonanza plasmonica di superficie convaliderà il riconoscimento del bersaglio. Quindi, l’assemblaggio del composto ibrido GelMA-NP sarà ottenuto mediante stampa 3D per estrusione secondo pipeline di produzione standardizzate. L'idrogel e la sospensione di NP verranno erogati attraverso ugelli separati, in modelli 2D e 3D con dimensioni di 100-1000 nm, sotto controllo di pressione e temperatura. Verranno utilizzate e poi valutate le concentrazioni scalari di NP.

L'integrità delle NP e le dinamiche di rilascio di queste da GelMA saranno studiate immergendo le GelMA-NP caricate con composto fluorescente con un mezzo di crescita cellulare biomimetico e quantificando le NP rilasciate nel surnatante in esperimenti nel tempo. La quantificazione delle NP verrà eseguita utilizzando la spettroscopia UV-Vis, la spettroscopia a fluorescenza o il conteggio delle particelle come il sistema NTA. L'integrità delle NP sarà studiata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e DLS.

Una volta caratterizzate biochimicamente le GelMA-NP, queste verranno utilizzate per fornire composti bioattivi identificati attraverso dati di proteomica come successivamente descritto.

Per convalidare il bioinchiostro sviluppato in modelli di malattie craniofacciali in vitro, i pazienti con malformazioni craniofacciali sottoposti a chirurgia cranica saranno selezionati e arruolati nello studio. Nello specifico, verranno arruolati pazienti pediatrici affetti da craniosinostosi e altri difetti congeniti, traumi o tumori cerebrali sottoposti a chirurgia cranica. Verranno selezionati e arruolati anche pazienti adulti sottoposti a chirurgia craniofacciale per traumi e tumori craniofacciali. A questo scopo, campioni di tessuto osseo cranico derivati ​​da pazienti sia pediatrici che adulti saranno ottenuti come rifiuti chirurgici durante craniectomia o rimodellamento della volta cranica previo ottenimento del consenso informato firmato (da parte dei genitori in caso di bambini). Per ciascun paziente, i tessuti di scarto verranno randomizzati in tre aliquote. Di questi, 1 aliquota verrà raccolta nel terreno di crescita cellulare per seminare campioni di tessuto osseo in piastre di coltura per isolare le cellule mesenchimali stromali (MSC). Successivamente, le MSC verranno espanse fino al 3° passaggio colturale e raccolte in infrastrutture di biobanche con dati clinici anonimi associati e sistema di tracciamento ottimizzato per la successiva analisi come segue. Il rilascio e la biocompatibilità delle NP del bioinchiostro basato su GelMA saranno analizzati utilizzando MSC, attraverso test funzionali per: valutare la dinamica dell'adesione focale e studiare l'adesione cellulare al bioinchiostro gelificato mediante test di immunofluorescenza. Il comportamento e la vitalità cellulare saranno misurati in esperimenti nel tempo utilizzando un sistema di imaging di cellule vive (sistemi Incucyte Live Cells Analysis).

Inoltre, 2 aliquote di campioni di tessuto osseo prelevati dai pazienti verranno congelati in azoto liquido (dopo averlo immerso in un mezzo crioprotettivo con inibitori della proteasi). Proteine ​​e metaboliti verranno isolati da questi campioni utilizzando un protocollo standardizzato interno. I campioni estratti verranno quindi digeriti utilizzando il protocollo di digestione con preparazione del campione assistita da filtro (FASP). Quindi, i campioni verranno analizzati mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Anche i metaboliti saranno valutati mediante LC-MS/MS e saranno separati mediante HPLC. Quindi, i risultati ottenuti su proteine ​​e metaboliti verranno analizzati mediante analisi di percorso integrato (utilizzando IPA) per ottenere il profilo multiomico di ciascun paziente identificando così bersagli farmacologici da sfruttare nella progettazione dei farmaci. Verranno utilizzati strumenti di progettazione computazionale dei farmaci, tra cui il docking molecolare e lo screening virtuale, per identificare i composti guida da database di farmaci/chimici in grado di interagire con i bersagli selezionati dai set di dati del profilo omico integrato. Il comportamento dinamico, la stabilità e le interazioni di legame dei complessi bersaglio-ligando saranno studiati attraverso simulazioni di dinamica molecolare (MD) per analizzare motivi di legame e hotspot. Gli approfondimenti forniti dai MD sulle interazioni molecolari guideranno la progettazione e l'ottimizzazione di nuovi composti. Ciò comporterà l'integrazione di modifiche strutturali con approcci basati su ligandi e l'esecuzione di screening virtuali per migliorare l'affinità di legame, la selettività e la somiglianza con i farmaci. Le biomolecole identificate attraverso questi studi in silico verranno quindi acquistate commercialmente e incapsulate in NP PLGA. A questo proposito, la nanoprecipitazione e la singola emulsione saranno sfruttate per i carichi utili idrofobici, mentre la tecnica di evaporazione del solvente a doppia emulsione (w1/o/w2) sarà impiegata per i carichi utili idrofili. Successivamente, il PLGA che fornisce i composti selezionati verrà complessato nella matrice di idrogel (GelMA). Le proprietà funzionali trofiche e pro-rigenerative del composto bioinchiostro che fornisce biomolecole saranno valutate in MSC per testare le proprietà osteogeniche - attraverso il test dell'attività ALP, la colorazione della mineralizzazione in vitro e l'analisi dell'espressione genica marcatrice. Inoltre, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (linea commerciale) saranno trattate con il complesso farmacologico GelMA-NP per valutare le proprietà angiogeniche mediante conteggio e dimensionamento delle strutture simili a capillari formate in vitro (test di formazione del tubo).

Inoltre, verrà raccolta una piccola aliquota di sangue venoso periferico (2-3 ml per i pazienti pediatrici e fino a 7 ml per i pazienti adulti) proveniente dagli esami clinici di routine. Le PBMC verranno isolate dal campione di sangue intero utilizzando la tecnica di centrifugazione in gradiente di densità Ficoll. Le cellule monociti/macrofagiche verranno quindi separate attraverso sfere magnetiche coniugate con anticorpo CD14 e coltivate in vitro con fattori (es. M-CSF, RANKL) per formare osteoclasti maturi. Questi verranno utilizzati per valutare la bioriassorbibilità del composto GelMA-NP. In breve, gli osteoclasti verranno seminati sulle superfici nanomodellate GelMA-NP e l'espressione dei tipici marcatori specifici degli osteoclasti sarà valutata mediante analisi di immunofluorescenza. Verranno utilizzati test SEM e immunofluorescenza per visualizzare ultrastrutturalmente l'interfaccia osteoclasti-bioinchiostro e discriminare il riassorbimento bi e tridimensionale.

MSC/osteoprogenitori e osteoclasti derivati ​​dai pazienti verranno inoltre sfruttati per ottenere colture in vitro 2D e 3D per imitare il microambiente biologico esistente al confine osso-impianto per la validazione del complesso bioinchiostro sviluppato. I componenti del bioinchiostro verranno biostampati con cellule (cioè cellule erogate attraverso un ugello indipendente) per formare modelli carichi di cellule, oppure stampati sulla superficie di crescita dei vasi di coltura cellulare e lasciati gelificare prima della semina cellulare, in base agli obiettivi di ciascun test. Le dinamiche di rilascio di NP dal GelMA, la vitalità e la proliferazione cellulare, gli effetti angiogenici e rigenerativi dell'osso saranno valutati come menzionato sopra.

Per testare i suoi effetti antibatterici, sia il GelMA scaricato che il GelMA-NP verranno stampati su piastre Petri e lasciati gelificare. Successivamente verrà incubato con i ceppi batterici opportunisti (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis e Pseudomonas aeruginosa) nel brodo di coltura appropriato per una notte. L'adesione e la conta batterica saranno valutate comparativamente, testando gli effetti correlati alla dose e al tempo. L'attività antibatterica di GelMA-NP rispetto a GelMA sarà supportata anche dall'imaging SEM.