Bioink funcionalizada que fornece biomoléculas para o tratamento de doenças craniofaciais (DART-CRAFT)

Para desenvolver uma matriz polimérica biossintética moldável à base de colágeno, hidrogéis comerciais à base de gelatina-metacrilamida (GelMA) serão modificados bioquimicamente para ajustar sua pseudo-plasticidade e tensão de rendimento, e funcionalizados para implementar a entrega de medicamentos para propriedades biológicas melhoradas. O GelMA será enriquecido quimicamente com: moléculas adesivas (por ex. compostos inorgânicos à base de alginato ou liberadores de íons), se necessário, para aumentar a adesão a materiais implantáveis ​​usados ​​na reconstrução craniofacial, fotoiniciadores não do tipo clivagem à base de tiol (por exemplo, eosinaY combinada com trietanolamina e vinil caprolactama) para permitir reticulação ativada por luz visível e minimizar as preocupações de segurança da luz UV. A foto-reticulação será obtida através de um dispositivo portátil de luz visível (420-480 nm) para induzir a gelificação da biotinta. As propriedades físicas (morfologia, propriedades viscoelásticas, rigidez, resistência a uma tensão aplicada) dos diferentes compostos GelMA serão analisadas de acordo com procedimentos padronizados. As propriedades adesivas do GelMA serão medidas por testes de resistência ao cisalhamento em condições secas. Uma vez identificados os compostos GelMA que apresentem as mais elevadas características biológicas, este será dotado de nanopartículas (NPs) à base de Poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA).

Para este objetivo, NPs biocompatíveis de PLGA-Polietilenoglicol (PEG) serão sintetizadas e funcionalizadas com bis-sulfona para ligação de porções de direcionamento na superfície. A síntese envolve ativação de PLGA, conjugação de PLGA-PEG, ativação de bissulfona e conjugação de PLGA-PEG-bis-sulfona. A relação PLGA/PEG será ajustada para a carga útil de hidrofobicidade/hidrofilicidade. A bissulfona é usada para PEGuilação seletiva e eficiente da ligação dissulfeto da proteína ou para conjugar proteínas/peptídeos marcados com His de acordo com métodos padronizados para implementar direcionamento celular específico ou agentes antimicrobianos. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) será utilizada para validar a reação biossintética. Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) e Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) definirão as propriedades morfológicas e ultraestruturais da construção final. A Ressonância Plasmon de Superfície validará o reconhecimento do alvo. Em seguida, a montagem do composto híbrido GelMA-NP será obtida por meio de impressão 3D por extrusão de acordo com pipelines de produção padronizados. O hidrogel e a suspensão NP serão dispensados ​​através de bicos separados, em padrões 2D e 3D com tamanhos característicos de 100-1000 nm, sob controle de pressão e temperatura. Concentrações escalares de NP serão utilizadas e então avaliadas.

A integridade de NP e a dinâmica de liberação destes do GelMA serão estudadas submergindo os GelMA-NPs carregados com composto fluorescente com um meio de crescimento celular biomimético e quantificando os NPs liberados no sobrenadante em experimentos de curso de tempo. A quantificação de NP será realizada utilizando Espectroscopia UV-Vis, Espectroscopia de Fluorescência ou contagem de partículas como sistema NTA. A integridade das NPs será estudada com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e DLS.

Uma vez caracterizados bioquimicamente os GelMA-NPs, estes serão utilizados para fornecer compostos bioativos identificados através de dados proteômicos conforme descrito posteriormente.

Para validar a biotinta desenvolvida em modelos de doenças craniofaciais in vitro, pacientes com malformações craniofaciais submetidos à cirurgia craniana serão selecionados e inscritos no estudo. Especificamente, serão inscritos pacientes pediátricos afetados por craniossinostose e outros defeitos congênitos, traumas ou tumores cerebrais submetidos à cirurgia craniana. Pacientes adultos submetidos à cirurgia craniofacial também serão selecionados e inscritos para traumas e tumores craniofaciais. Para tanto, amostras de tecido ósseo craniano derivadas de pacientes pediátricos e adultos serão obtidas como resíduo cirúrgico durante craniectomia ou remodelação da abóbada craniana mediante obtenção do consentimento informado assinado (pelos pais no caso de crianças). Para cada paciente, os resíduos de tecidos serão randomizados em três alíquotas. Destes, 1 alíquota será coletada em meio de crescimento celular para semeadura de amostras de tecido ósseo em placa de cultura para isolamento de células estromais mesenquimais (MSCs). Posteriormente, o MSC será expandido até a 3ª passagem de cultura e coletado em infraestruturas de biobancos com dados clínicos anonimizados associados e sistema de rastreamento otimizado para análise subsequente como segue. A liberação e biocompatibilidade da biotinta NP baseada em GelMA serão analisadas usando MSC, por meio de ensaios funcionais para: avaliar a dinâmica de adesão focal e estudar a adesão celular à biotinta gelificada por ensaio de imunofluorescência. O comportamento e a viabilidade celular serão medidos em experimentos de curso de tempo usando um sistema de imagem de células vivas (sistemas Incucyte Live Cells Analysis).

Além disso, 2 alíquotas de tecido ósseo derivado de pacientes serão congeladas rapidamente em nitrogênio líquido (após submergir em meio crioprotetor com inibidores de protease). Proteínas e metabólitos serão isolados dessas amostras usando protocolo padronizado interno. As amostras extraídas serão então digeridas usando o protocolo de digestão de preparação de amostra auxiliada por filtro (FASP). Em seguida, as amostras serão analisadas por Espectrometria de Massa Tandem por Cromatografia Líquida (LC-MS/MS). Também os metabólitos serão avaliados por LC-MS/MS e serão separados por HPLC. Em seguida, os resultados obtidos em proteínas e metabólitos serão analisados ​​​​por análise de vias integradas (usando IPA) para alcançar o perfil multiômico de cada paciente, identificando assim alvos drogáveis ​​a serem explorados no projeto de medicamentos. Ferramentas computacionais de design de medicamentos, incluindo acoplamento molecular e triagem virtual, serão empregadas para identificar os compostos principais de bancos de dados de medicamentos/produtos químicos capazes de interagir com os alvos selecionados a partir dos conjuntos de dados de perfil ômico integrados. O comportamento dinâmico, a estabilidade e as interações de ligação dos complexos alvo-ligante serão estudados através de simulações de dinâmica molecular (MD) para analisar motivos de ligação e hotspots. Insights informados por MD sobre interações moleculares orientarão o projeto e a otimização de novos compostos. Isto envolverá a incorporação de modificações estruturais com abordagens baseadas em ligantes e a realização de triagem virtual para aumentar a afinidade de ligação, seletividade e semelhança com o medicamento. As biomoléculas identificadas através destes estudos in silico serão então adquiridas comercialmente e encapsuladas em NPs de PLGA. A este respeito, a nanoprecipitação e a emulsão única serão exploradas para cargas hidrofóbicas, enquanto a técnica de evaporação de solvente de emulsão dupla (w1/o/w2) será empregada para cargas hidrofílicas. Após, o PLGA entregando os compostos selecionados será complexado em matriz de hidrogel (GelMA). As propriedades funcionais tróficas e pró-regenerativas do composto bioink que fornece biomoléculas serão avaliadas em MSC para testar propriedades osteogênicas - através de ensaio de atividade de ALP, coloração de mineralização in vitro e análise de expressão gênica de marcadores. Além disso, células endoteliais da veia umbilical humana (linha comercial) serão tratadas com complexo de drogas GelMA-NPs para avaliação das propriedades angiogênicas por meio da contagem e dimensionamento das estruturas semelhantes a capilares formadas in vitro (ensaio de formação de tubo).

Além disso, será coletada uma pequena alíquota de sangue venoso periférico (2-3 ml para pacientes pediátricos e até 7 ml para pacientes adultos) de exames clínicos de rotina. PBMCs serão isoladas de amostra de sangue total usando técnica de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll. As células monócitos/macrófagos serão então separadas através de esferas magnéticas conjugadas com anticorpo CD14 e cultivadas in vitro com fatores (ou seja, M-CSF, RANKL) para formar osteoclastos maduros. Estes serão utilizados para avaliar a bio-reabsorção do composto GelMA-NP. Resumidamente, os osteoclastos serão semeados nas superfícies nanopadronizadas GelMA-NP e a expressão de marcadores típicos específicos de osteoclastos será avaliada através de análise de imunofluorescência. SEM e ensaio de imunofluorescência serão utilizados para visualizar ultraestruturalmente a interface osteoclasto-bioink e discriminar a reabsorção bi e tridimensionalmente.

MSC/osteoprogenitores e osteoclastos derivados de pacientes também serão explorados para obter cultura in vitro 2D e 3D para imitar o microambiente biológico existente na fronteira osso-implante para a validação do complexo de biotinta desenvolvido. Os componentes da biotinta serão bioimpressos com células (ou seja, células entregues através de um bocal independente) para formar modelos carregados de células, ou impressos na superfície de crescimento de vasos de cultura celular e deixados gelificar antes da semeadura celular, de acordo com os objetivos de cada teste. A dinâmica de liberação de NP do GelMA, viabilidade e proliferação celular, efeitos angiogênicos e regenerativos ósseos serão avaliados conforme mencionado acima.

Para testar seus efeitos antibacterianos, tanto o GelMA descarregado quanto o GelMA-NP serão impressos em placas de Petri e deixados gelificar. Posteriormente será incubado com as cepas bacterianas oportunistas (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis e Pseudomonas aeruginosa) no caldo de cultura apropriado durante a noite. A adesão bacteriana e a contagem serão avaliadas comparativamente, testando os efeitos relacionados à dose e ao tempo. A atividade antibacteriana do GelMA-NP sobre o GelMA também será apoiada por imagens SEM.