Funktionaliserad Bioink som levererar biomolekyler för behandling av kraniofaciala sjukdomar (DART-CRAFT)

För att utveckla en formbar biosyntetisk kollagenbaserad polymermatris kommer kommersiella gelatin-metakrylamid (GelMA)-baserade hydrogeler att biokemiskt modifieras för att finjustera deras pseudo-plasticitet och sträckningsspänning, och funktionaliseras för att implementera läkemedelsleverans för förbättrade biologiska egenskaper. GelMA kommer att berikas kemiskt med: adhesiva molekyler (t.ex. alginatbaserade eller jonfrisättande oorganiska föreningar), om det behövs, för att öka vidhäftningen till implanterbara material som används vid kraniofacial rekonstruktion, tiolbaserade fotoinitiatorer av icke-klyvningstyp (t.ex. eosinY kombinerat med trietanolamin och vinylkaprolaktam) för att möjliggöra synligt ljus-aktiverad tvärbindning och minimera säkerhetsproblemen med UV-ljus. Fototvärbindning kommer att uppnås genom en bärbar anordning för synligt ljus (420-480 nm) för att inducera jellifiering av biobläcket. De fysikaliska egenskaperna (morfologi, viskoelastiska egenskaper, styvhet, motståndskraft mot påfrestningar) hos de olika GelMA-föreningarna kommer att analyseras enligt standardiserade procedurer. GelMA:s vidhäftningsegenskaper kommer att mätas genom tester av skjuvhållfasthet under torra förhållanden. När gelMA-föreningar har identifierats som visar de högsta biologiska egenskaperna, kommer detta att förses med funktionaliserade poly (mjölk-samglykolsyra) (PLGA)-baserade nanopartiklar (NP).

För detta syfte kommer biokompatibla PLGA-polyetylenglykol (PEG) NP:er att syntetiseras och funktionaliseras med bis-sulfon för att binda målgrupper på ytan. Syntesen involverar PLGA-aktivering, PLGA-PEG-konjugering, bis-sulfonaktivering och PLGA-PEG-bis-sulfon-konjugering. PLGA/PEG-förhållandet kommer att justeras för hydrofobicitet/hydrofilicitets nyttolast. Bis-sulfon används för selektiv och effektiv PEGylering av proteinets disulfidbindning eller för att konjugera His-märkta protein/peptider enligt standardiserade metoder för att implementera antingen specifik cellmålsökning eller antimikrobiella medel. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kommer att användas för att validera den biosyntetiska reaktionen. Dynamisk ljusspridning (DLS), nanopartikelspårningsanalys (NTA) och svepelektronmikroskopi (SEM) kommer att definiera de morfologiska och ultrastrukturella egenskaperna hos den slutliga konstruktionen. Surface Plasmon Resonance kommer att validera måligenkänning. Sedan kommer GelMA-NP-hybridsammansättning att uppnås genom extrudering 3D-utskrift enligt standardiserade produktionspipelines. Hydrogelen och NP-suspensionen kommer att dispenseras genom separata munstycken, i 2D- och 3D-mönster med 100-1000 nm funktionsstorlekar, under tryck och temperaturkontroll. Skalära NP-koncentrationer kommer att användas och sedan utvärderas.

NP-integritet och frisättningsdynamik för dessa från GelMA kommer att studeras genom att nedsänka GelMA-NP laddade med fluorescerande förening med ett biomimetiskt celltillväxtmedium och kvantifiera de NP som frisätts i supernatanten i tidsförloppsexperiment. NP-kvantifiering kommer att utföras med hjälp av UV-Vis-spektroskopi, fluorescensspektroskopi eller partikelräkning såsom NTA-system. NPs integritet kommer att studeras med transmissionselektronmikroskopi (TEM) och DLS.

En gång biokemiskt karakteriserade GelMA-NPs kommer dessa att användas för att leverera bioaktiva föreningar identifierade genom proteomikdata som beskrivs nedan.

För att validera det utvecklade biobläcket i kraniofaciala sjukdomsmodeller in vitro, kommer patienter med kraniofaciala missbildningar som genomgår kraniokirurgi att väljas ut och inkluderas i studien. Specifikt kommer pediatriska patienter som drabbats av kraniosynostos och andra medfödda defekter, trauma eller hjärntumörer som genomgår kranial kirurgi att registreras. Vuxna patienter som genomgår kraniofacial kirurgi kommer också att väljas ut och registreras för kraniofacial trauma och tumörer. För detta ändamål kommer kranialbensvävnadsprover från både pediatriska och vuxna patienter att erhållas som kirurgiskt avfall under kraniektomi eller ombyggnad av kranialvalvet efter att ha erhållit det undertecknade informerade samtycket (av föräldrar om det gäller barn). För varje patient kommer avfallsvävnaderna att randomiseras i tre alikvoter. Av dessa kommer 1 alikvot att samlas in i celltillväxtmedium för sådd av benvävnadsprover i odlingsplattan för att isolera mesenkymala stromaceller (MSC). Därefter kommer MSC att utökas upp till den 3:e kulturpassagen och samlas in i biobanksinfrastrukturer med tillhörande anonymiserade kliniska data och optimerat spårningssystem för efterföljande analys enligt följande. GelMA-baserad bioink NP-frisättning och biokompatibilitet kommer att analyseras med hjälp av MSC, genom funktionella analyser för att: utvärdera fokal adhesionsdynamik och studera celladhesion till det gelifierade biobläcket genom immunfluorescensanalys. Cellbeteenden och livsduglighet kommer att mätas i tidsförloppsexperiment med hjälp av ett levande cellavbildningssystem (Incucyte Live Cells Analysis-system).

Dessutom kommer 2 alikvoter av benvävnadsprover från patienter att snabbfrysas i flytande kväve (efter att det har nedsänkts i kryoskyddande medium med proteashämmare). Proteiner och metaboliter kommer att isoleras från dessa prover med hjälp av interna standardiserade protokoll. Extraherade prover kommer sedan att smältas med hjälp av filter-aided sample preparering (FASP) digestion protokoll. Därefter kommer proverna att analyseras med vätskekromatografi Tandemmasspektrometri (LC-MS/MS). Även metaboliter kommer att bedömas med LC-MS/MS och kommer att separeras med HPLC. Sedan kommer erhållna resultat på proteiner och metaboliter att analyseras genom integrerad väganalys (med IPA) för att uppnå multiomisk profilering av varje patient och därmed identifiera läkemedelsbara mål som ska utnyttjas i läkemedelsdesign. Beräkningsverktyg för läkemedelsdesign, inklusive molekylär dockning och virtuell screening, kommer att användas för att identifiera de ledande föreningarna från läkemedels-/kemiska databaser som kan interagera med de utvalda målen från de integrerade omic-profildatauppsättningarna. Det dynamiska beteendet, stabiliteten och bindningsinteraktionerna hos mål-ligandkomplex kommer att studeras genom simuleringar av molekylär dynamik (MD) för att analysera bindningsmotiv och hotspots. MD-informerade insikter om molekylära interaktioner kommer att vägleda design och optimering av nya föreningar. Detta kommer att involvera inkorporering av strukturella modifieringar med ligandbaserade tillvägagångssätt och att utföra virtuell screening för att förbättra bindningsaffinitet, selektivitet och läkemedelslikhet. De biomolekyler som identifierats genom dessa i silicostudier kommer sedan att köpas kommersiellt och inkapslas i PLGA NP. I detta avseende kommer nanofällning och enkel emulsion att utnyttjas för hydrofoba nyttolaster, medan dubbelemulsionslösningsmedelsförångningsteknik (w1/o/w2) kommer att användas för hydrofila nyttolaster. Därefter kommer PLGA som levererar utvalda föreningar att komplexbindas till hydrogel (GelMA) matris. De funktionella trofiska och pro-regenerativa egenskaperna hos biobläckföreningen som levererar biomolekyler kommer att utvärderas i MSC för att testa osteogena egenskaper - genom ALP-aktivitetsanalys, in vitro mineraliseringsfärgning och analys av markörgenexpression. Dessutom kommer humana navelvenendotelceller (kommersiell linje) att behandlas med GelMA-NPs-läkemedelskomplex för att utvärdera de angiogena egenskaperna genom att räkna och dimensionera de kapillärliknande strukturerna som bildas in vitro (rörbildningsanalys).

Dessutom kommer en liten alikvot perifert venöst blod (2-3 ml för pediatriska patienter och upp till 7 ml för vuxna patienter) från rutinmässiga kliniska undersökningar att samlas in. PBMC kommer att isoleras från helblodsprov med Ficoll densitetsgradientcentrifugeringsteknik. Monocyt-/makrofagceller kommer sedan att separeras genom CD14-antikroppskonjugerade magnetiska pärlor och odlas in vitro med faktorer (dvs. M-CSF, RANKL) för att bilda mogna osteoklaster. Dessa kommer att användas för att utvärdera den biologiska resorberbarheten hos GelMA-NP-föreningen. Kortfattat kommer osteoklaster att sås på GelMA-NP nanomönstrade ytor och uttrycket av typiska osteoklastspecifika markörer kommer att bedömas genom immunfluorescensanalys. SEM och immunfluorescensanalys kommer att användas för att visualisera ultrastrukturellt gränssnittet mellan osteoklast och biobläck och särskilja resorption två- och tredimensionellt.

MSC/osteoprogenitorer och osteoklaster som härrör från patienter kommer också att utnyttjas för att erhålla 2D- och 3D-kultur in vitro för att efterlikna den biologiska mikromiljön som finns vid ben-implantatgränsen för validering av det utvecklade biobläckkomplexet. Biobläckkomponenterna kommer antingen att biotryckas med celler (dvs. celler levereras genom ett oberoende munstycke) för att bilda cellladdade modeller, eller tryckas på tillväxtytan av cellodlingskärl och låta jelifieras innan cellsådd, enligt syftet med varje test. Frisättningsdynamiken för NP från GelMA, cellviabilitet och proliferation, angiogena och benregenerativa effekter kommer att bedömas som nämnts ovan.

För att testa dess antibakteriella effekter kommer både den oladdade GelMA och GelMA-NP att tryckas på petriskålar och låta jelifiera. Därefter kommer den att inkuberas med de opportunistiska bakteriestammarna (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis och Pseudomonas aeruginosa) i lämplig odlingsbuljong över natten. Bakterievidhäftning och -antal kommer att bedömas jämförande och testa dos- och tidsrelaterade effekter. Antibakteriell aktivitet av GelMA-NP över GelMA kommer också att stödjas av SEM-avbildning.