Funksjonalisert bioink som leverer biomolekyler for behandling av kraniofaciale sykdommer (DART-CRAFT)

For å utvikle en formbar biosyntetisk kollagenbasert polymermatrise, vil kommersielle gelatin-metakrylamid (GelMA)-baserte hydrogeler bli biokjemisk modifisert for å finjustere deres pseudo-plastisitet og flytespenning, og funksjonalisert for å implementere medikamentlevering for forbedrede biologiske egenskaper. GelMA vil bli kjemisk beriket med: klebende molekyler (f.eks. alginatbaserte eller ionefrigjørende uorganiske forbindelser), om nødvendig, for å øke adhesjonen til implanterbare materialer som brukes i kraniofacial rekonstruksjon, tiolbaserte fotoinitiatorer av ikke-spaltningstype (f.eks. eosinY kombinert med trietanolamin og vinylkaprolaktam) for å muliggjøre synlig lysaktivert tverrbinding og minimere sikkerhetsproblemene ved UV-lys. Foto-tverrbinding vil bli oppnådd gjennom en bærbar synlig lysenhet (420-480 nm) for å indusere jellifisering av bioblekk. De fysiske egenskapene (morfologi, viskoelastiske egenskaper, stivhet, motstand mot påført stress) til de forskjellige GelMA-forbindelsene vil bli analysert i henhold til standardiserte prosedyrer. Klemegenskapene til GelMA vil bli målt ved test av skjærstyrke under tørre forhold. Når de har identifisert GelMA-forbindelser som viser de høyeste biologiske egenskapene, vil dette bli utstyrt med funksjonaliserte Poly (melke-ko-glykolsyre) (PLGA)-baserte nanopartikler (NP).

For dette målet vil biokompatible PLGA-polyetylenglykol (PEG) NP-er syntetiseres og funksjonaliseres med bis-sulfon for å binde målrettingsenheter på overflaten. Syntesen involverer PLGA-aktivering, PLGA-PEG-konjugering, bis-sulfon-aktivering og PLGA-PEG-bis-sulfon-konjugering. PLGA/PEG-forholdet vil bli justert for nyttelasten for hydrofobitet/hydrofilisitet. Bis-sulfon brukes til selektiv og effektiv PEGylering av proteinets disulfidbinding eller for å konjugere His-merkede protein/peptider i henhold til standardiserte metoder for å implementere enten spesifikk cellemålretting eller antimikrobielle midler. Høyytelses væskekromatografi (HPLC) vil bli brukt for å validere den biosyntetiske reaksjonen. Dynamisk lysspredning (DLS), nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og skanningselektronmikroskopi (SEM) vil definere de morfologiske og ultrastrukturelle egenskapene til den endelige konstruksjonen. Surface Plasmon Resonance vil validere målgjenkjenning. Deretter vil GelMA-NP-hybridsammensetning oppnås gjennom ekstrudering 3D-utskrift i henhold til standardiserte produksjonsrørledninger. Hydrogelen og NP-suspensjonen vil bli dispensert gjennom separate dyser, i 2D- og 3D-mønstre med 100-1000 nm funksjonsstørrelser, under trykk- og temperaturkontroll. Skalare NP-konsentrasjoner vil bli brukt og deretter evaluert.

NP-integritet og frigjøringsdynamikk til disse fra GelMA vil bli studert ved å senke GelMA-NP-ene lastet med fluorescerende forbindelse med et bio-mimetisk cellevekstmedium og kvantifisere NP-ene som frigjøres i supernatanten i tidsforløpsforsøk. NP-kvantifisering vil bli utført ved bruk av UV-Vis-spektroskopi, fluorescensspektroskopi eller partikkeltelling som NTA-system. NPs integritet vil bli studert med transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og DLS.

Når de er biokjemisk karakteriserte GelMA-NP-er, vil disse bli brukt til å levere bioaktive forbindelser identifisert gjennom proteomikkdata som beskrevet senere.

For å validere det utviklede bio-blekk i in vitro kraniofacial sykdomsmodeller, vil pasienter med kraniofaciale misdannelser som gjennomgår kraniekirurgi bli valgt ut og innrullert i studien. Spesielt vil pediatriske pasienter som er rammet av kraniosynostose og andre medfødte defekter, traumer eller hjernesvulster som gjennomgår kranial kirurgi bli registrert. Voksne pasienter som gjennomgår kraniofacial kirurgi vil også bli valgt ut og registrert for kraniofacial traumer og svulster. For dette formålet vil kraniebeinvevsprøver fra både pediatriske og voksne pasienter innhentes som kirurgisk avfall under kraniektomi eller ombygging av kraniehvelvet etter å ha innhentet det signerte informerte samtykket (av foreldre i tilfelle barn). For hver pasient vil avfallsvevet bli randomisert i tre alikvoter. Av disse vil 1 aliquot samles i cellevekstmedium for såing av benvevsprøver i kulturplaten for å isolere mesenkymale stromale celler (MSCs). Deretter vil MSC utvides frem til 3. kulturpassasje og samles inn i biobankinfrastrukturer med tilhørende anonymiserte kliniske data og optimert sporingssystem for påfølgende analyse som følger. GelMA-basert bioink NP-frigjøring og biokompatibilitet vil bli analysert ved hjelp av MSC, gjennom funksjonelle analyser for å: evaluere fokal adhesjonsdynamikk og studere celleadhesjon til det gelifiserte bioblekk ved immunfluorescensanalyse. Celleatferd og levedyktighet vil bli målt i tidsforløpseksperimenter ved bruk av et levende celleavbildningssystem (Incucyte Live Cells Analysis-systemer).

I tillegg vil 2 alikvoter av pasientavledede benvevsprøver bli hurtigfrosset i flytende nitrogen (etter nedsenking i kryobeskyttende medium med proteasehemmere). Proteiner og metabolitter vil bli isolert fra disse prøvene ved hjelp av intern standardisert protokoll. Ekstraherte prøver vil deretter fordøyes ved å bruke filter-aided sample preparering (FASP) fordøyelsesprotokoll. Deretter vil prøvene bli analysert med væskekromatografi Tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Også metabolitter vil bli vurdert ved LC-MS/MS og vil bli separert ved HPLC. Deretter vil oppnådde resultater på proteiner og metabolitter analyseres ved integrert baneanalyse (ved bruk av IPA) for å oppnå multiomisk profilering av hver pasient og dermed identifisere medisinerbare mål som skal utnyttes i legemiddeldesign. Beregningsbaserte legemiddeldesignverktøy, inkludert molekylær dokking og virtuell screening, vil bli brukt for å identifisere hovedforbindelsene fra legemiddel-/kjemiske databaser som er i stand til å samhandle med de valgte målene fra de integrerte omic-profildatasettene. Den dynamiske oppførselen, stabiliteten og bindingsinteraksjonene til mål-ligandkomplekser vil bli studert gjennom molekylær dynamikk (MD) simuleringer for å analysere bindingsmotiver og hotspots. MD-informert innsikt om molekylære interaksjoner vil lede utformingen og optimaliseringen av nye forbindelser. Dette vil innebære å inkorporere strukturelle modifikasjoner med ligandbaserte tilnærminger, og utføre virtuell screening for å forbedre bindingsaffinitet, selektivitet og medikamentlikhet. Biomolekylene identifisert gjennom disse i silico-studier vil deretter bli kommersielt kjøpt og innkapslet i PLGA NP-er. I denne forbindelse vil nanoutfelling og enkeltemulsjon bli utnyttet for hydrofobe nyttelaster, mens dobbeltemulsjonsløsningsmiddelfordampningsteknikk (w1/o/w2) vil bli brukt for hydrofile nyttelaster. Deretter vil PLGA som leverer utvalgte forbindelser komplekssettes til hydrogel (GelMA) matrise. De funksjonelle trofiske og pro-regenerative egenskapene til bioblekkforbindelsen som leverer biomolekyler vil bli vurdert i MSC for å teste osteogene egenskaper - gjennom ALP-aktivitetsanalyse, in vitro mineraliseringsfarging og markørgenekspresjonsanalyse. I tillegg vil humane navlevene-endotelceller (kommersiell linje) bli behandlet med GelMA-NPs-medikamentkompleks for å evaluere de angiogene egenskapene ved å telle og dimensjonere de kapillærlignende strukturene dannet in vitro (rørdannelsesanalyse).

I tillegg vil en liten aliquot av perifert veneblod (2-3 ml for pediatriske pasienter og opptil 7 ml for voksne pasienter) fra rutinemessige kliniske undersøkelser bli samlet inn. PBMC-er vil bli isolert fra fullblodsprøve ved bruk av Ficoll-densitetsgradient-sentrifugeringsteknikk. Monocytt-/makrofagceller vil deretter separeres gjennom CD14-antistoffkonjugerte magnetiske kuler og dyrkes in vitro med faktorer (dvs. M-CSF, RANKL) for å danne modne osteoklaster. Disse vil bli brukt til å evaluere bio-resorberbarheten til GelMA-NP-forbindelsen. Kort fortalt vil osteoklaster bli sådd på GelMA-NP nanomønstrede overflater og uttrykket av typiske osteoklastspesifikke markører vil bli vurdert gjennom immunfluorescensanalyse. SEM og immunfluorescensanalyse vil bli brukt til å visualisere ultrastrukturelt osteoklast-bioink-grensesnittet og diskriminere resorpsjon to- og tredimensjonalt.

MSC/osteoprogenitorer og osteoklaster avledet fra pasienter vil også bli utnyttet for å oppnå 2D og 3D in vitro kultur for å etterligne det biologiske mikromiljøet som eksisterer ved bein-implantatgrensen for validering av det utviklede bioblekkkomplekset. Bioblekkkomponentene vil enten bli bioprintet med celler (dvs. celler levert gjennom en uavhengig dyse) for å danne celleladede modeller, eller trykt på vekstoverflaten til cellekulturkar og la jelisere før cellesåing, i henhold til målene for hver test. Frigjøringsdynamikken til NP fra GelMA, cellelevedyktighet og proliferasjon, angiogene og beinregenerative effekter vil bli vurdert som nevnt ovenfor.

For å teste dens antibakterielle virkning, vil både den ubelastede GelMA og GelMA-NP bli trykt på petriskåler og la jelisere. Deretter vil det bli inkubert med de opportunistiske bakteriestammene (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis og Pseudomonas aeruginosa) i passende kulturbuljong over natten. Bakteriell adhesjon og telling vil bli vurdert sammenlignet, testing av dose- og tidsrelaterte effekter. Antibakteriell aktivitet av GelMA-NP over GelMA, vil også bli støttet av SEM-avbildning.