Funkcionalizált Bioink szállító biomolekulák az arckoponya-betegségek kezelésére (DART-CRAFT)

A formázható bioszintetikus kollagén alapú polimer mátrix kifejlesztéséhez a kereskedelmi forgalomban lévő zselatin-metakrilamid (GelMA) alapú hidrogélt biokémiailag módosítják, hogy finoman hangolják pszeudo-plaszticitásukat és folyási feszültségüket, és funkcionalizálják a gyógyszeradagolás megvalósítását a jobb biológiai tulajdonságok érdekében. A GelMA kémiailag dúsított lesz: ragasztómolekulákkal (pl. alginát alapú vagy ionleadó szervetlen vegyületek), ha szükséges, a koponya-arc-rekonstrukció során használt beültethető anyagokhoz való tapadás fokozására, tiol alapú, nem hasadás típusú fotoiniciátorok (pl. eozinY trietanol-aminnal és vinil-kaprolaktámmal kombinálva), hogy lehetővé tegye a látható fény által aktivált térhálósodást és minimalizálja az UV-fény biztonsági aggályait. A foto-térhálósítást egy hordozható látható fény eszközzel (420-480 nm) érik el a biotinta kocsonyásodásának indukálására. A különböző GelMA vegyületek fizikai tulajdonságait (morfológia, viszkoelasztikus tulajdonságok, merevség, alkalmazott igénybevétellel szembeni ellenállás) szabványos eljárások szerint elemzik. A GelMA tapadási tulajdonságait lapnyíró szilárdsági tesztekkel mérik száraz körülmények között. Miután azonosították a legmagasabb biológiai tulajdonságokat mutató GelMA-vegyületeket, ezek funkcionalizált Poly (tej-ko-glikolsav) (PLGA) alapú nanorészecskékkel (NP-kkel) lesznek felruházva.

Ebből a célból biokompatibilis PLGA-polietilénglikol (PEG) NP-ket szintetizálnak és funkcionalizálnak bisz-szulfonnal, hogy megkötik a felszínen a célcsoportokat. A szintézis magában foglalja a PLGA aktiválást, a PLGA-PEG konjugációt, a bisz-szulfon aktiválást és a PLGA-PEG-bisz-szulfon konjugációt. A PLGA/PEG arány a hidrofób/hidrofil hasznos terheléshez lesz igazítva. A bisz-szulfont a fehérje diszulfidkötésének szelektív és hatékony PEGilezésére vagy a His-toldalékkal jelölt fehérjék/peptidek konjugálására használják szabványos módszerek szerint, akár specifikus sejtcélzás, akár antimikrobiális szerek megvalósítása érdekében. A bioszintetikus reakció validálására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) fognak használni. A dinamikus fényszórás (DLS), a nanorészecskék követési elemzése (NTA) és a pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) meghatározzák a végső konstrukció morfológiai és ultrastrukturális tulajdonságait. A Surface Plasmon Resonance validálja a célfelismerést. Ezután a GelMA-NP hibrid keverék összeszerelését extrudált 3D nyomtatással, szabványos gyártási folyamatok szerint valósítják meg. A hidrogél és az NP szuszpenzió külön fúvókákon keresztül, 2D és 3D mintázatban, 100-1000 nm-es jellemzőmérettel, nyomás- és hőmérsékletszabályozás mellett kerül adagolásra. Skaláris NP-koncentrációkat kell használni, majd kiértékelni.

Az NP integritását és ezek felszabadulási dinamikáját a GelMA-ból úgy vizsgáljuk, hogy a fluoreszcens vegyülettel feltöltött GelMA-NP-ket biomimetikus sejttenyésztő tápközegbe merítjük, és időbeli kísérletekben számszerűsítjük a felülúszóban felszabaduló NP-ket. Az NP mennyiségi meghatározását UV-Vis spektroszkópiával, fluoreszcencia spektroszkópiával vagy részecskeszámlálással, például NTA rendszerrel végezzük. Az NP-k integritását transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) és DLS-sel vizsgálják.

Miután biokémiailag jellemezték a GelMA-NP-ket, ezeket felhasználják a proteomikai adatok alapján azonosított bioaktív vegyületek szállítására, a későbbiekben leírtak szerint.

A kifejlesztett bio-tinta in vitro koponya-arcbetegség modellekben történő validálásához koponyaműtéten átesett koponya-arc-fejlődési rendellenességben szenvedő betegeket választanak ki és vonnak be a vizsgálatba. Konkrétan koponyaműtéten átesett, craniosynostosisban és más veleszületett rendellenességekben, traumában vagy agydaganatban szenvedő gyermekgyógyászati ​​betegek kerülnek felvételre. Az arckoponya-műtéten átesett felnőtt betegeket is kiválasztják és beíratják koponyasérülések és daganatok miatt. Ebből a célból a koponyaeltávolítás vagy a koponyaboltozat átalakítás során műtéti hulladékként mind a gyermek-, mind a felnőtt betegektől származó koponyacsontszövet-mintákat az aláírt, tájékozott beleegyezéssel (gyermekek esetén a szülők részéről) veszik. Minden beteg esetében a hulladékszöveteket véletlenszerűen három alikvot részre osztják. Ebből 1 alikvot részt sejttenyésztő tápközegben gyűjtünk, hogy csontszövet-mintákat oltsunk a tenyésztőlemezre a mezenchimális stromasejtek (MSC) izolálására. Ezt követően az MSC-t kiterjesztik a 3. tenyészetig, és biobanki infrastruktúrákban gyűjtik össze a kapcsolódó anonim klinikai adatokkal és optimalizált nyomkövető rendszerrel a későbbi elemzésekhez, az alábbiak szerint. A GelMA-alapú biotinta NP felszabadulását és biokompatibilitását MSC segítségével, funkcionális vizsgálatok segítségével elemezzük, hogy: értékeljük a fokális adhéziós dinamikát és tanulmányozzuk a sejt adhézióját a gélesedett biotintához immunfluoreszcens vizsgálattal. A sejtek viselkedését és életképességét időbeli kísérletekben mérik élő sejt képalkotó rendszerrel (Incucyte Live Cells Analysis Systems).

Ezenkívül a betegektől származó csontszövetminták 2 aliquot részét folyékony nitrogénben lefagyasztják (miután proteázgátlókkal ellátott krioprotektív táptalajba merítették). Ezekből a mintákból a fehérjéket és metabolitokat házon belüli szabványosított protokoll segítségével izolálják. A kivont mintákat ezután megemésztik a szűrővel támogatott minta-előkészítés (FASP) emésztési protokoll segítségével. Ezután a mintákat folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) elemzik. A metabolitokat is LC-MS/MS-sel értékeljük, és HPLC-vel választjuk el. Ezután a fehérjéken és metabolitokon kapott eredményeket integrált útvonal-analízissel elemzik (IPA használatával), hogy elérjék az egyes betegek multiomikus profiljait, így azonosítva a gyógyszertervezésben hasznosítható, gyógyszeres célpontokat. Számítógépes gyógyszertervezési eszközöket, köztük molekuláris dokkolást és virtuális szűrést alkalmaznak a vezető vegyületek azonosítására olyan gyógyszer/kémiai adatbázisokból, amelyek képesek kölcsönhatásba lépni az integrált omic profil adatkészletekből kiválasztott célpontokkal. A cél-ligandum komplexek dinamikus viselkedését, stabilitását és kötési kölcsönhatásait molekuláris dinamikai (MD) szimulációkkal tanulmányozzák a kötési motívumok és hotspotok elemzése céljából. A molekuláris kölcsönhatásokra vonatkozó MD-informált betekintések irányítják az új vegyületek tervezését és optimalizálását. Ez magában foglalja a szerkezeti módosítások ligandum alapú megközelítésekkel történő beépítését, és virtuális szűrést a kötési affinitás, a szelektivitás és a gyógyszerszerűség fokozása érdekében. Az ezekben az in silico vizsgálatokban azonosított biomolekulákat ezután kereskedelmi forgalomban megvásárolják és PLGA NP-kbe kapszulázzák. Ebben a tekintetben a nanoprecipitációt és az egyszeres emulziót használják ki a hidrofób hasznos tehereknél, míg a kettős emulziós oldószer elpárologtatási technikát (w1/o/w2) a hidrofil hasznos tehereknél. Ezt követően a kiválasztott vegyületeket szállító PLGA hidrogél (GelMA) mátrixba komplexálódik. A biomolekulákat szállító biotintavegyület funkcionális trofikus és pro-regeneratív tulajdonságait MSC-ben értékelik az oszteogén tulajdonságok tesztelésére - ALP-aktivitási vizsgálattal, in vitro mineralizációs festéssel és markergén-expressziós elemzéssel. Ezen túlmenően humán köldökvéna endothel sejteket (kereskedelmi vonal) kezelünk GelMA-NPs-gyógyszer komplexszel, hogy kiértékeljük az angiogén tulajdonságokat az in vitro képződött kapillárisszerű struktúrák megszámlálásával és méretezésével (tube formation assay).

Ezenkívül a rutin klinikai vizsgálatokból egy kis alikvot perifériás vénás vért gyűjtenek (2-3 ml gyermekbetegeknél és legfeljebb 7 ml felnőtt betegeknél). A PBMC-ket teljes vérmintából Ficoll sűrűséggradiens centrifugálási technikával izolálják. A monocita/makrofág sejteket ezután elválasztják CD14 antitesttel konjugált mágneses gyöngyökön keresztül, és in vitro tenyésztjük faktorokkal (pl. M-CSF, RANKL) érett oszteoklasztok képzésére. Ezeket a GelMA-NP vegyület biológiai felszívódási képességének értékelésére használjuk fel. Röviden, oszteoklasztokat oltunk a GelMA-NP nanomintázatú felületekre, és a tipikus oszteoklaszt-specifikus markerek expresszióját immunfluoreszcencia analízissel értékeljük. A SEM és az immunfluoreszcens vizsgálatot az oszteoklaszt-bioink interfész ultrastrukturális megjelenítésére és a reszorpció két- és háromdimenziós megkülönböztetésére használjuk.

A betegekből származó MSC/osteoprogenitorokat és oszteoklasztokat is felhasználják majd 2D és 3D in vitro tenyészet előállítására, a csont-implantátum határán létező biológiai mikrokörnyezet imitálására a kifejlesztett biotintakomplex validálásához. A biotinta-komponenseket vagy sejtekkel bionyomtatják (azaz független fúvókán keresztül szállított sejteket), hogy sejttel terhelt modelleket hozzanak létre, vagy a sejttenyésztőedények növekedési felületére nyomtatják, és hagyják kocsonyásodni a sejtbeültetés előtt, az egyes tesztek céljainak megfelelően. Az NP felszabadulási dinamikáját a GelMA-ból, a sejtek életképességét és proliferációját, angiogén és csontregeneratív hatásait a fent említettek szerint értékeljük.

Antibakteriális hatásának tesztelése érdekében a kirakott GelMA-t és a GelMA-NP-t is Petri-csészékre nyomtatják, és hagyják megzselézni. Ezt követően az opportunista baktériumtörzsekkel (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis és Pseudomonas aeruginosa) megfelelő tenyészlében egy éjszakán át. A baktériumok adhézióját és számát összehasonlító módon értékelik, tesztelve a dózis- és időfüggő hatásokat. A GelMA-NP antibakteriális aktivitását a GelMA-hoz képest SEM képalkotás is támogatja.