Функционализированные биочернила, доставляющие биомолекулы для лечения черепно-лицевых заболеваний (DART-CRAFT)

Для разработки формованной биосинтетической полимерной матрицы на основе коллагена коммерческие гидрогели на основе желатина-метакриламида (GelMA) будут биохимически модифицированы для точной настройки их псевдопластичности и предела текучести, а также функционализированы для реализации доставки лекарств для улучшения биологических свойств. GelMA будет химически обогащен: молекулами клея (например, неорганические соединения на основе альгината или ионы, высвобождающие), при необходимости, для увеличения адгезии к имплантируемым материалам, используемым в черепно-лицевой реконструкции, фотоинициаторы нерасщепляемого типа на основе тиола (например, эозина в сочетании с триэтаноламином и винилкапролактамом), чтобы обеспечить сшивку, активируемую видимым светом, и свести к минимуму проблемы безопасности, связанные с ультрафиолетовым излучением. Фотосшивка будет осуществляться с помощью портативного устройства видимого света (420-480 нм), чтобы вызвать желирование биочернил. Физические свойства (морфология, вязкоупругие свойства, жесткость, устойчивость к приложенному напряжению) различных соединений GelMA будут проанализированы в соответствии со стандартизированными процедурами. Адгезивные свойства GelMA будут измеряться испытаниями на прочность на сдвиг внахлест в сухих условиях. Как только будут идентифицированы соединения GelMA, обладающие наиболее высокими биологическими свойствами, они будут наделены функционализированными наночастицами (НП) на основе поли (молочно-гликолевой кислоты) (PLGA).

С этой целью будут синтезированы биосовместимые наночастицы PLGA-полиэтиленгликоля (ПЭГ) и функционализированы бис-сульфоном для связывания нацеливающихся фрагментов на поверхности. Синтез включает активацию PLGA, конъюгацию PLGA-PEG, активацию биссульфона и конъюгацию PLGA-PEG-биссульфона. Соотношение PLGA/PEG будет скорректировано с учетом полезной нагрузки гидрофобности/гидрофильности. Бис-сульфон используется для селективного и эффективного ПЭГилирования дисульфидной связи белка или для конъюгации белков/пептидов, меченных His, в соответствии со стандартизованными методами для реализации либо специфического нацеливания на клетки, либо противомикробных агентов. Для проверки реакции биосинтеза будет использоваться высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Динамическое рассеяние света (DLS), анализ отслеживания наночастиц (NTA) и сканирующая электронная микроскопия (SEM) определят морфологические и ультраструктурные свойства окончательной конструкции. Поверхностный плазмонный резонанс подтвердит распознавание цели. Затем сборка гибридного соединения GelMA-NP будет осуществляться посредством экструзионной 3D-печати в соответствии со стандартизированными производственными конвейерами. Гидрогель и суспензия NP будут дозироваться через отдельные сопла в 2D и 3D формах с размером элементов 100-1000 нм под контролем давления и температуры. Будут использованы скалярные концентрации NP, а затем оценены.

Целостность НЧ и динамика их высвобождения из GelMA будут изучены путем погружения НЧ GelMA, загруженных флуоресцентным соединением, в биомиметическую среду для роста клеток и количественного определения НЧ, высвободившихся в супернатанте, в экспериментах с временными изменениями. Количественное определение NP будет проводиться с использованием УФ-Вид-спектроскопии, флуоресцентной спектроскопии или подсчета частиц, например системы NTA. Целостность НЧ будут изучать с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и ДРС.

После биохимической характеристики GelMA-NP они будут использоваться для доставки биоактивных соединений, идентифицированных с помощью данных протеомики, как описано ниже.

Для проверки разработанных биочернил на моделях черепно-лицевых заболеваний in vitro в исследование будут отобраны и включены в исследование пациенты с черепно-лицевыми пороками развития, перенесшие краниальную хирургию. В частности, будут включены педиатрические пациенты, страдающие краниосиностозом и другими врожденными дефектами, травмами или опухолями головного мозга, подвергающиеся краниальной хирургии. Взрослые пациенты, перенесшие черепно-лицевую хирургию, также будут отобраны и зачислены по поводу черепно-лицевых травм и опухолей. С этой целью образцы костной ткани черепа, полученные как от детей, так и от взрослых пациентов, будут получены в качестве хирургических отходов во время краниэктомии или ремоделирования свода черепа после получения подписанного информированного согласия (родителями в случае детей). Для каждого пациента отходы тканей будут рандомизированы на три аликвоты. Из них 1 аликвота будет собрана в среде для роста клеток для посева образцов костной ткани в культуральный планшет для выделения мезенхимальных стромальных клеток (МСК). После этого MSC будут расширены до третьего пассажа культуры и собраны в инфраструктурах биобанков с соответствующими анонимными клиническими данными и оптимизированной системой отслеживания для последующего анализа следующим образом. Высвобождение и биосовместимость NP биочернил на основе GelMA будут проанализированы с использованием MSC с помощью функциональных анализов, чтобы: оценить динамику фокальной адгезии и изучить адгезию клеток к гелеобразным биочернилам с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Поведение и жизнеспособность клеток будут измеряться в ходе экспериментов с временными интервалами с использованием системы визуализации живых клеток (системы анализа живых клеток Incucyte).

Кроме того, 2 аликвоты образцов костной ткани, полученных от пациентов, будут быстро заморожены в жидком азоте (после погружения в криозащитную среду с ингибиторами протеаз). Белки и метаболиты будут выделены из этих образцов с использованием собственного стандартизированного протокола. Затем извлеченные образцы будут переварены с использованием протокола расщепления с фильтрацией проб (FASP). Затем образцы будут проанализированы с помощью жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Также метаболиты будут оцениваться с помощью ЖХ-МС/МС и разделяться с помощью ВЭЖХ. Затем полученные результаты по белкам и метаболитам будут проанализированы с помощью комплексного анализа путей (с использованием IPA) для достижения мультиомного профилирования каждого пациента, таким образом определяя мишени, которые можно использовать при разработке лекарств. Инструменты компьютерного проектирования лекарств, включая молекулярную стыковку и виртуальный скрининг, будут использоваться для идентификации ведущих соединений из баз данных о лекарствах/химических веществах, способных взаимодействовать с выбранными мишенями из интегрированных наборов данных омических профилей. Динамическое поведение, стабильность и связывающие взаимодействия комплексов мишень-лиганд будут изучены с помощью моделирования молекулярной динамики (МД) для анализа мотивов связывания и горячих точек. Информация о молекулярных взаимодействиях, основанная на результатах медицинских исследований, будет служить основой для разработки и оптимизации новых соединений. Это будет включать в себя включение структурных модификаций с использованием лигандных подходов и проведение виртуального скрининга для повышения аффинности связывания, селективности и сходства с лекарственными средствами. Биомолекулы, идентифицированные в ходе этих исследований in silico, будут затем коммерчески приобретены и инкапсулированы в наночастицы PLGA. В этом отношении наноосаждение и одиночная эмульсия будут использоваться для гидрофобных полезных нагрузок, а метод испарения растворителя с двойной эмульсией (w1/o/w2) будет использоваться для гидрофильных полезных нагрузок. После этого PLGA, доставляющий выбранные соединения, будет объединен в матрицу гидрогеля (GelMA). Функциональные трофические и прорегенеративные свойства соединения биочернил, доставляющего биомолекулы, будут оцениваться в МСК для проверки остеогенных свойств - с помощью анализа активности ЩФ, окрашивания минерализации in vitro и анализа экспрессии маркерных генов. Кроме того, эндотелиальные клетки пупочной вены человека (коммерческая линия) будут обработаны комплексом GelMA-NPs-лекарственное средство для оценки ангиогенных свойств путем подсчета и определения размера капилляроподобных структур, образующихся in vitro (анализ образования трубок).

Кроме того, при рутинных клинических исследованиях будет собрана небольшая аликвота периферической венозной крови (2-3 мл у детей и до 7 мл у взрослых). РВМС будут выделены из образца цельной крови с использованием метода центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Затем моноциты/макрофаги будут разделяться с помощью магнитных шариков, конъюгированных с антителами CD14, и культивироваться in vitro с факторами (т.е. M-CSF, RANKL) для образования зрелых остеокластов. Они будут использоваться для оценки биорезорбируемости соединения GelMA-NP. Вкратце, остеокласты будут высеяны на поверхности с наноструктурой GelMA-NP, и экспрессия типичных специфичных для остеокластов маркеров будет оцениваться с помощью иммунофлуоресцентного анализа. СЭМ и иммунофлуоресцентный анализ будут использоваться для ультраструктурной визуализации границы раздела остеокласт-биочернила и различения резорбции в двух- и трехмерном виде.

МСК/остеопрогениторы и остеокласты, полученные от пациентов, также будут использоваться для получения 2D и 3D культуры in vitro для имитации биологической микросреды, существующей на границе кость-имплантат, для проверки разработанного комплекса биочернил. Компоненты биочернил будут либо напечатаны с помощью биопечати с клетками (т. е. клетки будут доставлены через независимое сопло) для формирования насыщенных клетками моделей, либо напечатаны на поверхности роста сосудов для клеточных культур и подвергнуты гелеобразованию перед посевом клеток, в зависимости от целей каждого теста. Динамику высвобождения NP из GelMA, жизнеспособность и пролиферацию клеток, ангиогенные и регенеративные эффекты костной ткани будут оценивать, как указано выше.

Чтобы проверить его антибактериальное действие, как ненагруженный GelMA, так и GelMA-NP будут напечатаны на чашках Петри и подвергнуты желированию. После этого он будет инкубирован со штаммами условно-патогенных бактерий (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis и Pseudomonas aeruginosa) в соответствующем культуральном бульоне на ночь. Адгезия и количество бактерий будут оцениваться сравнительно, проверяя эффекты, связанные с дозой и временем. Антибактериальная активность GelMA-NP по сравнению с GelMA также будет подтверждена методами СЭМ.