Funkcjonalny biotusz dostarczający biomolekuły do ​​leczenia chorób twarzoczaszki (DART-CRAFT)

Aby opracować formowalną biosyntetyczną matrycę polimerową na bazie kolagenu, dostępne na rynku hydrożele na bazie żelatyny i metakryloamidu (GelMA) zostaną zmodyfikowane biochemicznie w celu dokładnego dostosowania ich pseudoplastyczności i granicy plastyczności, a także funkcjonalizowane w celu wprowadzenia leku w celu uzyskania ulepszonych właściwości biologicznych. GelMA zostanie wzbogacona chemicznie o: cząsteczki kleju (np. na bazie alginianów lub związków nieorganicznych uwalniających jony), w razie potrzeby w celu zwiększenia adhezji do materiałów wszczepialnych stosowanych w rekonstrukcji czaszkowo-twarzowej, fotoinicjatorów nierozszczepiających na bazie tioli (np. eozyna Y w połączeniu z trietanoloaminą i winylokaprolaktamem), aby umożliwić sieciowanie aktywowane światłem widzialnym i zminimalizować zagrożenia związane z bezpieczeństwem światła UV. Fotosieciowanie zostanie osiągnięte za pomocą przenośnego urządzenia emitującego światło widzialne (420–480 nm) w celu wywołania żelowania biotuszu. Właściwości fizyczne (morfologia, właściwości lepkosprężyste, sztywność, odporność na przyłożone naprężenia) różnych związków GelMA będą analizowane zgodnie ze standardowymi procedurami. Właściwości adhezyjne GelMA zostaną zmierzone za pomocą testów wytrzymałości na ścinanie w warunkach suchych. Po zidentyfikowaniu związków GelMA wykazujących najwyższe cechy biologiczne, zostaną one wyposażone w funkcjonalizowane nanocząstki (NP) na bazie poli(kwasu mlekowego i glikolowego) (PLGA).

W tym celu biokompatybilne nanocząsteczki PLGA-glikolu polietylenowego (PEG) zostaną zsyntetyzowane i funkcjonalizowane bis-sulfonem w celu wiązania ugrupowań kierujących na powierzchni. Synteza obejmuje aktywację PLGA, koniugację PLGA-PEG, aktywację bis-sulfonu i koniugację PLGA-PEG-bis-sulfon. Stosunek PLGA/PEG zostanie dostosowany do ładunku hydrofobowości/hydrofilowości. Bis-sulfon stosuje się do selektywnej i skutecznej PEGylacji wiązania dwusiarczkowego białka lub do sprzęgania białka/peptydów ze znacznikiem His zgodnie ze standardowymi metodami w celu wdrożenia albo specyficznych środków nakierowanych na komórki, albo środków przeciwdrobnoustrojowych. Do walidacji reakcji biosyntezy zostanie zastosowana wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), analiza śledzenia nanocząstek (NTA) i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) pozwolą określić właściwości morfologiczne i ultrastrukturalne ostatecznego konstruktu. Powierzchniowy rezonans plazmonowy potwierdzi rozpoznanie celu. Następnie montaż mieszanki hybrydowej GelMA-NP zostanie osiągnięty poprzez druk ekstruzyjny 3D zgodnie ze znormalizowanymi rurociągami produkcyjnymi. Hydrożel i zawiesina NP będą dozowane za pomocą oddzielnych dysz, we wzorach 2D i 3D, o rozmiarach elementów 100–1000 nm, pod kontrolą ciśnienia i temperatury. Zostaną wykorzystane, a następnie ocenione stężenia skalarne NP.

Integralność nanocząsteczek i dynamika ich uwalniania z GelMA będą badane poprzez zanurzenie nanocząstek GelMA-NP obciążonych związkiem fluorescencyjnym w biomimetycznej pożywce do wzrostu komórek i oznaczenie ilościowe nanocząsteczek uwolnionych w supernatancie w eksperymentach z przebiegiem czasu. Kwantyfikacja nanocząstek zostanie przeprowadzona przy użyciu spektroskopii UV-Vis, spektroskopii fluorescencyjnej lub zliczania cząstek, np. systemu NTA. Integralność nanocząsteczek będzie badana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i DLS.

Po biochemicznym scharakteryzowaniu GelMA-NP zostaną one wykorzystane do dostarczenia związków bioaktywnych zidentyfikowanych na podstawie danych proteomicznych, jak opisano poniżej.

Aby zweryfikować opracowany biotusz w modelach chorób twarzoczaszki in vitro, do badania zostaną wybrani i włączeni do badania pacjenci z wadami rozwojowymi czaszkowo-twarzowej poddawani zabiegom chirurgicznym czaszki. Do badania zostaną włączeni w szczególności pacjenci pediatryczni dotknięci kraniosynostozą i innymi wadami wrodzonymi, urazami lub guzami mózgu poddawani operacjom czaszki. Dorośli pacjenci poddawani operacjom twarzoczaszki zostaną również wybrani i zapisani do leczenia urazów twarzoczaszki i nowotworów. W tym celu próbki tkanki kostnej czaszki pochodzące od pacjentów pediatrycznych i dorosłych będą pobierane jako odpad chirurgiczny podczas kraniektomii lub przebudowy sklepienia czaszki po uzyskaniu podpisanej świadomej zgody (w przypadku dzieci przez rodziców). Dla każdego pacjenta tkanki odpadowe zostaną losowo podzielone na trzy porcje. Spośród nich 1 porcja zostanie zebrana w pożywce do wzrostu komórek w celu wysiania próbek tkanki kostnej na płytkę hodowlaną w celu wyizolowania mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC). Następnie MSC zostanie rozszerzony do trzeciego pasażu hodowli i zgromadzony w infrastrukturze biobanków wraz z powiązanymi anonimowymi danymi klinicznymi i zoptymalizowanym systemem śledzenia do późniejszej analizy w następujący sposób. Uwalnianie i biokompatybilność NP biotuszu na bazie GelMA będą analizowane przy użyciu MSC, poprzez testy funkcjonalne w celu: oceny dynamiki adhezji ogniskowej i badania adhezji komórek do zżelowanego biotuszu za pomocą testu immunofluorescencyjnego. Zachowanie i żywotność komórek będzie mierzone w eksperymentach z przebiegiem czasu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek (systemy analizy żywych komórek Incucyte).

Dodatkowo 2 porcje próbek tkanki kostnej pochodzącej od pacjenta zostaną szybko zamrożone w ciekłym azocie (po zanurzeniu w pożywce krioprotekcyjnej z inhibitorami proteaz). Białka i metabolity zostaną wyizolowane z tych próbek przy użyciu wewnętrznego standardowego protokołu. Wyekstrahowane próbki zostaną następnie poddane trawieniu przy użyciu protokołu trawienia przy użyciu filtra wspomaganego przygotowania próbki (FASP). Następnie próbki będą analizowane metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Również metabolity będą oceniane metodą LC-MS/MS i rozdzielane metodą HPLC. Następnie uzyskane wyniki dotyczące białek i metabolitów zostaną przeanalizowane za pomocą zintegrowanej analizy szlaków (przy użyciu IPA) w celu uzyskania profilowania multiomicznego każdego pacjenta, identyfikując w ten sposób cele nadające się do leczenia, które można wykorzystać przy projektowaniu leków. Narzędzia do obliczeniowego projektowania leków, w tym dokowanie molekularne i wirtualne badania przesiewowe, zostaną wykorzystane do identyfikacji wiodących związków z baz danych leków/chemikaliów zdolnych do interakcji z wybranymi celami ze zintegrowanych zbiorów danych profili omicznych. Dynamiczne zachowanie, stabilność i interakcje wiązania kompleksów cel-ligand będą badane za pomocą symulacji dynamiki molekularnej (MD) w celu analizy motywów wiązania i punktów aktywnych. Wiedza MD na temat interakcji molekularnych będzie wskazówką przy projektowaniu i optymalizacji nowych związków. Będzie to obejmować włączenie modyfikacji strukturalnych do podejść opartych na ligandach i przeprowadzenie wirtualnego przeglądu w celu zwiększenia powinowactwa wiązania, selektywności i podobieństwa leku. Biomolekuły zidentyfikowane w wyniku tych badań in silico zostaną następnie zakupione na rynku i kapsułkowane w nanocząsteczkach PLGA. W tym kontekście nanostrącanie i pojedyncza emulsja zostaną wykorzystane w przypadku ładunków hydrofobowych, natomiast technika odparowania rozpuszczalnika w podwójnej emulsji (w1/o/w2) zostanie zastosowana w przypadku ładunków hydrofilowych. Następnie PLGA dostarczająca wybrane związki zostanie skompleksowana z matrycą hydrożelową (GelMA). Funkcjonalne właściwości troficzne i proregeneracyjne związku biotuszu dostarczającego biocząsteczki zostaną ocenione w MSC w celu przetestowania właściwości osteogennych - poprzez test aktywności ALP, barwienie mineralizujące in vitro i analizę ekspresji genów markerowych. Dodatkowo, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (linia komercyjna) będą traktowane kompleksem GelMA-NPs-lek w celu oceny właściwości angiogennych poprzez zliczanie i wymiarowanie struktur kapilarnych utworzonych in vitro (test tworzenia rurek).

Ponadto zostanie pobrana niewielka porcja obwodowej krwi żylnej (2–3 ml w przypadku dzieci i do 7 ml w przypadku pacjentów dorosłych) z rutynowych badań klinicznych. PBMC zostaną wyizolowane z próbki pełnej krwi przy użyciu techniki wirowania w gradiencie gęstości Ficoll. Komórki monocytów/makrofagów zostaną następnie rozdzielone za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem CD14 i hodowane in vitro z czynnikami (tj. M-CSF, RANKL), tworząc dojrzałe osteoklasty. Zostaną one wykorzystane do oceny bioresorbowalności związku GelMA-NP. W skrócie, osteoklasty zostaną wysiane na powierzchnie z nanowzorem GelMA-NP, a ekspresja typowych markerów specyficznych dla osteoklastów zostanie oceniona za pomocą analizy immunofluorescencyjnej. Testy SEM i immunofluorescencyjne zostaną wykorzystane do ultrastrukturalnej wizualizacji powierzchni styku osteoklasty-biotusz i rozróżnienia resorpcji w dwóch i trzech wymiarach.

MSC/osteoprogenitory i osteoklasty pochodzące od pacjentów zostaną również wykorzystane do uzyskania hodowli in vitro 2D i 3D w celu naśladowania mikrośrodowiska biologicznego istniejącego na granicy kości i implantu w celu walidacji opracowanego kompleksu biotuszu. Składniki biotuszu zostaną albo poddane biodrukowi z komórkami (tj. komórkami dostarczonymi przez niezależną dyszę) w celu utworzenia modeli zawierających komórki, albo wydrukowane na powierzchni wzrostu naczyń do hodowli komórkowej i pozostawione do galaretowania przed zaszczepieniem komórek, zgodnie z celami każdego testu. Jak wspomniano powyżej, oceniana będzie dynamika uwalniania NP z GelMA, żywotność i proliferacja komórek, działanie angiogenne i regeneracyjne kości.

Aby przetestować jego działanie antybakteryjne, zarówno niezaładowany GelMA, jak i GelMA-NP zostaną wydrukowane na szalkach Petriego i pozostawione do galaretowania. Następnie będzie on inkubowany z oportunistycznymi szczepami bakterii (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis i Pseudomonas aeruginosa) w odpowiednim bulionie hodowlanym przez noc. Adhezja i liczba bakterii zostaną ocenione porównawczo, badając skutki zależne od dawki i czasu. Aktywność antybakteryjna GelMA-NP w stosunku do GelMA zostanie również potwierdzona obrazowaniem SEM.