Funktionaliseret bioink leverer biomolekyler til behandling af kraniofaciale sygdomme (DART-CRAFT)

For at udvikle en formbar biosyntetisk kollagenbaseret polymermatrix vil kommercielle gelatine-methacrylamid (GelMA)-baserede hydrogeler blive biokemisk modificeret for at finjustere deres pseudo-plasticitet og udbyttespænding og funktionaliseret til at implementere lægemiddellevering for forbedrede biologiske egenskaber. GelMA vil blive kemisk beriget med: klæbende molekyler (f.eks. alginatbaserede eller ionfrigivende uorganiske forbindelser), hvis det er nødvendigt, for at øge adhæsionen til implanterbare materialer, der anvendes til kraniofaciel rekonstruktion, thiol-baserede ikke-spaltnings-type fotoinitiatorer (f. eosinY kombineret med triethanolamin og vinylcaprolactam) for at muliggøre synligt lys-aktiveret tværbinding og minimere sikkerhedsproblemerne ved UV-lys. Foto-tværbinding vil blive opnået gennem en bærbar anordning til synligt lys (420-480 nm) for at inducere jellificering af bioblæk. De fysiske egenskaber (morfologi, viskoelastiske egenskaber, stivhed, modstand mod påført stress) af de forskellige GelMA-forbindelser vil blive analyseret i henhold til standardiserede procedurer. GelMA'ens klæbeegenskaber vil blive målt ved test af lap-forskydningsstyrke under tørre forhold. Når først identificeret GelMA-forbindelser, der viser de højeste biologiske egenskaber, vil dette være udstyret med funktionaliserede Poly (mælke-co-glykolsyre) (PLGA)-baserede nanopartikler (NP'er).

Til dette formål vil biokompatible PLGA-Polyethylenglycol (PEG) NP'er blive syntetiseret og funktionaliseret med bis-sulfon til binding af målrettede dele på overfladen. Syntesen involverer PLGA-aktivering, PLGA-PEG-konjugation, bis-sulfon-aktivering og PLGA-PEG-bis-sulfon-konjugation. PLGA/PEG-forholdet vil blive justeret for hydrofobicitet/hydrofilicitet nyttelast. Bis-sulfon bruges til selektiv og effektiv PEGylering af proteins disulfidbinding eller til at konjugere His-mærkede protein/peptider i henhold til standardiserede metoder til at implementere enten specifik cellemålretning eller antimikrobielle midler. Højtydende væskekromatografi (HPLC) vil blive brugt til at validere den biosyntetiske reaktion. Dynamisk lysspredning (DLS), nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og scanningselektronmikroskopi (SEM) vil definere den endelige konstruktions morfologiske og ultrastrukturelle egenskaber. Surface Plasmon Resonance vil validere målgenkendelse. Derefter vil GelMA-NP hybridsammensætning opnås gennem ekstrudering 3D-print i henhold til standardiserede produktionspipelines. Hydrogelen og NP-suspensionen vil blive dispenseret gennem separate dyser, i 2D- og 3D-mønstre med 100-1000 nm egenskabsstørrelser, under tryk og temperaturkontrol. Skalære NP-koncentrationer vil blive brugt og derefter evalueret.

NP-integritet og frigivelsesdynamik af disse fra GelMA vil blive studeret ved at nedsænke GelMA-NP'erne fyldt med fluorescerende forbindelse med et bio-mimetisk cellevækstmedium og kvantificere NP'erne frigivet i supernatanten i tidsforløbseksperimenter. NP-kvantificering vil blive udført ved hjælp af UV-Vis-spektroskopi, fluorescensspektroskopi eller partikeltælling såsom NTA-system. NPs integritet vil blive undersøgt med transmissionselektronmikroskopi (TEM) og DLS.

Når de først er biokemisk karakteriseret GelMA-NP'er, vil disse blive brugt til at levere bioaktive forbindelser identificeret gennem proteomiske data som efterfølgende beskrevet.

For at validere den udviklede bio-blæk i in vitro kraniofaciale sygdomsmodeller, vil patienter med kraniofaciale misdannelser, der gennemgår kraniekirurgi, blive udvalgt og indskrevet i undersøgelsen. Specifikt vil pædiatriske patienter, der er ramt af kraniosynostose og andre medfødte defekter, traumer eller hjernetumorer, der gennemgår kraniekirurgi, blive tilmeldt. Voksne patienter, der gennemgår kraniofacial kirurgi, vil også blive udvalgt og indskrevet til kraniofaciale traumer og tumorer. Til dette formål vil kranieknoglevævsprøver, der stammer fra både pædiatriske og voksne patienter, blive indhentet som kirurgisk affald under kraniektomi eller ombygning af kraniehvælvingen efter opnåelse af det underskrevne informerede samtykke (af forældre i tilfælde af børn). For hver patient vil affaldsvævene blive randomiseret i tre alikvoter. Af disse vil 1 aliquot blive opsamlet i cellevækstmedium til podning af knoglevævsprøver i kulturpladen for at isolere mesenkymale stromale celler (MSC'er). Herefter vil MSC blive udvidet op til 3. kulturpassage og opsamlet i biobank-infrastrukturer med tilhørende anonymiserede kliniske data og optimeret sporingssystem til efterfølgende analyse som følger. GelMA-baseret bioink NP-frigivelse og biokompatibilitet vil blive analyseret ved hjælp af MSC gennem funktionelle assays for at: evaluere fokal adhæsionsdynamik og studere celleadhæsion til det gelificerede bioink ved immunfluorescensassay. Celleadfærd og levedygtighed vil blive målt i tidsforløbseksperimenter ved hjælp af et levende cellebilleddannelsessystem (Incucyte Live Cells Analysis-systemer).

Derudover vil 2 alikvoter af patientafledte knoglevævsprøver blive lynfrosset i flydende nitrogen (efter nedsænkning i kryobeskyttende medium med proteasehæmmere). Proteiner og metabolitter vil blive isoleret fra disse prøver ved hjælp af intern standardiseret protokol. Ekstraherede prøver vil derefter blive fordøjet ved hjælp af filterstøttet prøveforberedelse (FASP) fordøjelsesprotokol. Derefter vil prøverne blive analyseret ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Også metabolitter vil blive vurderet ved LC-MS/MS og vil blive adskilt ved HPLC. Derefter vil opnåede resultater på proteiner og metabolitter blive analyseret ved integreret pathway-analyse (ved hjælp af IPA) for at opnå den multiomiske profilering af hver patient og dermed identificere lægemiddelbare mål, der skal udnyttes i lægemiddeldesign. Beregningsbaserede lægemiddeldesignværktøjer, herunder molekylær docking og virtuel screening, vil blive brugt til at identificere de ledende forbindelser fra lægemiddel-/kemiske databaser, der er i stand til at interagere med de udvalgte mål fra de integrerede omic-profildatasæt. Den dynamiske adfærd, stabilitet og bindingsinteraktioner af mål-ligand-komplekser vil blive studeret gennem Molecular dynamics (MD) simuleringer for at analysere bindingsmotiver og hotspots. MD-informeret indsigt i molekylære interaktioner vil guide design og optimering af nye forbindelser. Dette vil involvere inkorporering af strukturelle modifikationer med ligand-baserede tilgange og udførelse af virtuel screening for at øge bindingsaffinitet, selektivitet og lægemiddel-lignhed. Biomolekylerne identificeret gennem disse i silico-undersøgelser vil derefter blive kommercielt købt og indkapslet i PLGA NP'er. I denne henseende vil nanopræcipitation og enkelt emulsion blive udnyttet til hydrofobe nyttelaster, mens dobbeltemulsionsopløsningsmiddelfordampningsteknik (w1/o/w2) vil blive anvendt til hydrofile nyttelaster. Derefter vil PLGA, der leverer udvalgte forbindelser, blive kompleksdannet i hydrogel (GelMA) matrix. De funktionelle trofiske og pro-regenerative egenskaber af bioink-forbindelsen, der leverer biomolekyler, vil blive vurderet i MSC for at teste osteogene egenskaber - gennem ALP-aktivitetsassay, in vitro mineraliseringsfarvning og markørgenekspressionsanalyse. Derudover vil humane navlevene-endotelceller (kommerciel linje) blive behandlet med GelMA-NPs-lægemiddelkompleks for at evaluere de angiogene egenskaber ved at tælle og dimensionere de kapillærlignende strukturer dannet in vitro (rørdannelsesassay).

Derudover vil der blive indsamlet en lille portion perifert veneblod (2-3 ml til pædiatriske patienter og op til 7 ml for voksne patienter) fra rutinemæssige kliniske undersøgelser. PBMC'er vil blive isoleret fra fuldblodsprøve ved hjælp af Ficoll tæthedsgradient centrifugeringsteknik. Monocyt-/makrofageceller vil derefter blive adskilt gennem CD14-antistof-konjugerede magnetiske perler og dyrket in vitro med faktorer (dvs. M-CSF, RANKL) for at danne modne osteoklaster. Disse vil blive brugt til at evaluere den biologiske resorberbarhed af GelMA-NP-forbindelsen. Kort fortalt vil osteoklaster blive podet på de GelMA-NP nanomønstrede overflader, og ekspressionen af ​​typiske osteoklastspecifikke markører vil blive vurderet gennem immunfluorescensanalyse. SEM og immunfluorescensassay vil blive brugt til at visualisere ultrastrukturelt osteoklast-bioink-grænsefladen og skelne resorption to- og tredimensionelt.

MSC/osteoprogenitorer og osteoklaster afledt fra patienter vil også blive udnyttet til at opnå 2D og 3D in vitro kultur for at efterligne det biologiske mikromiljø, der eksisterer ved knogleimplantatgrænsen til validering af det udviklede bioinkkompleks. Bioink-komponenterne vil enten blive bioprintet med celler (dvs. celler leveret gennem en uafhængig dyse) for at danne celleladede modeller eller printet på vækstoverfladen af ​​cellekulturkar og ladet jelificere før cellepodning, i henhold til målene for hver test. Frigivelsesdynamikken af ​​NP fra GelMA, cellelevedygtighed og -proliferation, angiogene og knogleregenerative virkninger vil blive vurderet som nævnt ovenfor.

For at teste dens antibakterielle virkning vil både den aflastede GelMA og GelMA-NP blive printet på petriskåle og ladet jelificere. Derefter vil det blive inkuberet med de opportunistiske bakteriestammer (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis og Pseudomonas aeruginosa) i den passende kulturbouillon natten over. Bakterieadhæsion og -antal vil blive vurderet sammenlignende, idet dosis- og tidsrelaterede effekter testes. Antibakteriel aktivitet af GelMA-NP over GelMA vil også blive understøttet af SEM-billeddannelse.