Gefunctionaliseerde Bioink levert biomoleculen voor de behandeling van craniofaciale ziekten (DART-CRAFT)

Om een ​​vormbare biosynthetische, op collageen gebaseerde polymeermatrix te ontwikkelen, zullen commerciële op gelatine-methacrylamide (GelMA) gebaseerde hydrogels biochemisch worden gemodificeerd om hun pseudo-plasticiteit en vloeispanning nauwkeurig af te stemmen, en gefunctionaliseerd om medicijnafgifte te implementeren voor verbeterde biologische eigenschappen. De GelMA wordt chemisch verrijkt met: adhesieve moleculen (bijv. op alginaat gebaseerde of ionenafgevende anorganische verbindingen), indien nodig, om de hechting aan implanteerbare materialen die worden gebruikt bij craniofaciale reconstructie te vergroten, op thiol gebaseerde niet-splitsingstype foto-initiatoren (bijv. eosinY gecombineerd met triethanolamine en vinylcaprolactam) om door zichtbaar licht geactiveerde verknoping mogelijk te maken en de veiligheidsproblemen van UV-licht te minimaliseren. Foto-crosslinking zal worden bereikt door middel van een draagbaar apparaat voor zichtbaar licht (420-480 nm) om de gelering van de bio-inkt te induceren. De fysische eigenschappen (morfologie, visco-elastische eigenschappen, stijfheid, weerstand tegen uitgeoefende spanning) van de verschillende GelMA-verbindingen zullen worden geanalyseerd volgens gestandaardiseerde procedures. De adhesieve eigenschappen van de GelMA zullen worden gemeten door middel van lap-shear sterktetests in droge omstandigheden. Zodra GelMA-verbindingen zijn geïdentificeerd die de hoogste biologische kenmerken vertonen, zal deze worden voorzien van gefunctionaliseerde op poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) gebaseerde nanodeeltjes (NP's).

Om dit doel te bereiken zullen biocompatibele PLGA-polyethyleenglycol (PEG) NPs worden gesynthetiseerd en gefunctionaliseerd met bis-sulfon voor het binden van doelgerichte groepen op het oppervlak. De synthese omvat PLGA-activering, PLGA-PEG-conjugatie, bis-sulfon-activering en PLGA-PEG-bis-sulfon-conjugatie. De PLGA/PEG-verhouding wordt aangepast aan de hydrofobiciteit/hydrofiliciteitslading. Bis-sulfon wordt gebruikt voor selectieve en efficiënte PEGylering van de disulfidebinding van eiwitten of voor het conjugeren van met His gemerkte eiwitten/peptiden volgens gestandaardiseerde methoden om specifieke celtargeting of antimicrobiële middelen te implementeren. Hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) zal worden gebruikt om de biosynthesereactie te valideren. Dynamische lichtverstrooiing (DLS), Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) en Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) zullen de morfologische en ultrastructurele eigenschappen van het uiteindelijke construct definiëren. Surface Plasmon Resonance valideert doelherkenning. Vervolgens zal de assemblage van GelMA-NP hybride verbindingen worden bereikt door middel van extrusie 3D-printen volgens gestandaardiseerde productiepijplijnen. De hydrogel en de NP-suspensie zullen worden gedoseerd via afzonderlijke spuitmonden, in 2D- en 3D-patronen met featuregroottes van 100-1000 nm, onder druk- en temperatuurcontrole. Scalaire NP-concentraties zullen worden gebruikt en vervolgens geëvalueerd.

De NP-integriteit en de afgiftedynamiek hiervan uit GelMA zullen worden bestudeerd door de GelMA-NPs geladen met een fluorescerende verbinding onder te dompelen in een bio-mimetisch celgroeimedium en de NPs die vrijkomen in het supernatant te kwantificeren in tijdsverloopexperimenten. NP-kwantificering zal worden uitgevoerd met behulp van UV-Vis-spectroscopie, fluorescentiespectroscopie of deeltjestelling zoals een NTA-systeem. De integriteit van NP's zal worden bestudeerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en DLS.

Zodra GelMA-NP's biochemisch zijn gekarakteriseerd, zullen deze worden gebruikt om bioactieve verbindingen af ​​te leveren die zijn geïdentificeerd aan de hand van proteomics-gegevens, zoals later beschreven.

Om de ontwikkelde bio-inkt in in vitro modellen voor craniofaciale ziekten te valideren, zullen patiënten met craniofaciale misvormingen die een schedelchirurgie ondergaan, worden geselecteerd en aan de studie worden deelgenomen. In het bijzonder zullen pediatrische patiënten die getroffen zijn door craniosynostose en andere aangeboren afwijkingen, trauma of hersentumoren die een schedelchirurgie ondergaan, worden ingeschreven. Volwassen patiënten die craniofaciale chirurgie ondergaan, zullen ook worden geselecteerd en ingeschreven voor craniofaciale trauma's en tumoren. Voor dit doel zullen schedelbotweefselspecimens afkomstig van zowel pediatrische als volwassen patiënten worden verkregen als chirurgisch afval tijdens craniectomie of hermodellering van het schedeldak, na het verkrijgen van de ondertekende geïnformeerde toestemming (door ouders in het geval van kinderen). Voor elke patiënt worden de afvalweefsels gerandomiseerd in drie porties. Hiervan zal 1 portie worden verzameld in celgroeimedium voor het zaaien van botweefselmonsters in kweekplaten om mesenchymale stromale cellen (MSC's) te isoleren. Daarna zal MSC worden uitgebreid tot de 3e cultuurpassage en als volgt worden verzameld in biobankinfrastructuren met bijbehorende geanonimiseerde klinische gegevens en een geoptimaliseerd volgsysteem voor daaropvolgende analyse. Op GelMA gebaseerde bio-inkt NP-afgifte en biocompatibiliteit zullen worden geanalyseerd met behulp van MSC, door middel van functionele testen om: de focale adhesiedynamiek te evalueren en de celadhesie aan de gegeleerde bio-inkt te bestuderen door middel van immunofluorescentietest. Celgedrag en levensvatbaarheid zullen worden gemeten in tijdsverloopexperimenten met behulp van een live cell imaging-systeem (Incucyte Live Cells Analysis-systemen).

Bovendien zullen 2 aliquots van van de patiënt afkomstige botweefselspecimens snel worden ingevroren in vloeibare stikstof (na onderdompeling in cryoprotectief medium met proteaseremmers). Eiwitten en metabolieten zullen uit deze monsters worden geïsoleerd met behulp van een intern gestandaardiseerd protocol. De geëxtraheerde monsters zullen vervolgens worden verteerd met behulp van het Filter-aided monstervoorbereidingsprotocol (FASP). Vervolgens worden de monsters geanalyseerd met behulp van vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS/MS). Ook metabolieten zullen worden beoordeeld door middel van LC-MS/MS en zullen worden gescheiden door middel van HPLC. Vervolgens zullen de verkregen resultaten op het gebied van eiwitten en metabolieten worden geanalyseerd door middel van geïntegreerde routeanalyse (met behulp van IPA) om de multiomische profilering van elke patiënt te bereiken, waardoor behandelbare doelen worden geïdentificeerd die kunnen worden benut bij het ontwerpen van geneesmiddelen. Computationele hulpmiddelen voor het ontwerpen van geneesmiddelen, waaronder moleculaire docking en virtuele screening, zullen worden gebruikt om de leidende verbindingen te identificeren uit medicijn-/chemische databases die kunnen interageren met de geselecteerde doelen uit de geïntegreerde omic-profieldatasets. Het dynamische gedrag, de stabiliteit en de bindingsinteracties van doel-ligandcomplexen zullen worden bestudeerd via moleculaire dynamica (MD)-simulaties om bindingsmotieven en hotspots te analyseren. MD-geïnformeerde inzichten over moleculaire interacties zullen het ontwerp en de optimalisatie van nieuwe verbindingen begeleiden. Dit omvat het opnemen van structurele modificaties met op liganden gebaseerde benaderingen, en het uitvoeren van virtuele screening om de bindingsaffiniteit, selectiviteit en gelijkenis met geneesmiddelen te verbeteren. De biomoleculen die via deze in silico-onderzoeken worden geïdentificeerd, zullen vervolgens commercieel worden gekocht en ingekapseld in PLGA NP's. In dit opzicht zullen nanoprecipitatie en enkele emulsie worden benut voor hydrofobe ladingen, terwijl de dubbele-emulsie-oplosmiddelverdampingstechniek (w1/o/w2) zal worden gebruikt voor hydrofiele ladingen. Daarna zal PLGA, die geselecteerde verbindingen levert, worden gecomplexeerd tot een hydrogelmatrix (GelMA). De functionele trofische en pro-regeneratieve eigenschappen van de bio-inktverbinding die biomoleculen levert, zullen in MSC worden beoordeeld om osteogene eigenschappen te testen - door middel van ALP-activiteitstest, in vitro mineralisatiekleuring en analyse van markergenexpressie. Bovendien zullen menselijke endotheelcellen van de navelstrengader (commerciële lijn) worden behandeld met GelMA-NPs-medicijncomplex voor het evalueren van de angiogene eigenschappen door het tellen en op maat maken van de capillairachtige structuren die in vitro worden gevormd (buisvormingstest).

Daarnaast zal een kleine hoeveelheid perifeer veneus bloed (2-3 ml voor pediatrische patiënten en maximaal 7 ml voor volwassen patiënten) uit routinematige klinische onderzoeken worden verzameld. PBMC's zullen uit volbloedmonsters worden geïsoleerd met behulp van de Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatietechniek. Monocyt/macrofaagcellen zullen vervolgens worden gescheiden door middel van CD14-antilichaam-geconjugeerde magnetische korrels en in vitro worden gekweekt met factoren (d.w.z. M-CSF, RANKL) om volwassen osteoclasten te vormen. Deze zullen worden gebruikt om de bioresorbeerbaarheid van de GelMA-NP-verbinding te evalueren. In het kort zullen osteoclasten worden gezaaid op de gelMA-NP-oppervlakken met nanopatroon en de expressie van typische osteoclast-specifieke markers zal worden beoordeeld door middel van immunofluorescentieanalyse. SEM en immunofluorescentietesten zullen worden gebruikt om het osteoclast-bio-inktgrensvlak ultrastructureel te visualiseren en de resorptie twee- en driedimensionaal te onderscheiden.

MSC/osteoprogenitors en osteoclasten afgeleid van patiënten zullen ook worden benut om 2D- en 3D-in vitro-cultuur te verkrijgen om de biologische micro-omgeving na te bootsen die bestaat op de bot-implantaatgrens voor de validatie van het ontwikkelde bio-inktcomplex. De bio-inktcomponenten zullen ofwel worden gebioprint met cellen (dat wil zeggen cellen die via een onafhankelijk mondstuk worden afgeleverd) om met cellen beladen modellen te vormen, of worden afgedrukt op het groeioppervlak van celkweekvaten en laten geleren voordat de cellen worden gezaaid, afhankelijk van de doelstellingen van elke test. De afgiftedynamiek van NP uit de GelMA, cellevensvatbaarheid en proliferatie, angiogene en botregeneratieve effecten zullen worden beoordeeld zoals hierboven vermeld.

Om de antibacteriële werking ervan te testen, zullen zowel de onbeladen GelMA als de GelMA-NP op petrischalen worden gedrukt en laten geleren. Daarna zal het worden geïncubeerd met de opportunistische bacteriestammen (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis en Pseudomonas aeruginosa) in de juiste kweekbouillon gedurende de nacht. De bacteriële adhesie en het aantal bacteriën zullen vergelijkenderwijs worden beoordeeld, waarbij dosis- en tijdgerelateerde effecten zullen worden getest. De antibacteriële activiteit van GelMA-NP ten opzichte van GelMA zal ook worden ondersteund door SEM-beeldvorming.