Funkcionalizovaný bioinkoust poskytující biomolekuly pro léčbu kraniofaciálních onemocnění (DART-CRAFT)

Pro vývoj tvarovatelné biosyntetické polymerní matrice na bázi kolagenu budou komerční hydrogely na bázi želatiny-methakrylamidu (GelMA) biochemicky modifikovány, aby se jemně vyladila jejich pseudoplasticita a meze průtažnosti, a funkcionalizovány pro implementaci dodávání léčiv pro zlepšení biologických vlastností. GelMA bude chemicky obohacen o: adhezivní molekuly (např. anorganické sloučeniny na bázi alginátu nebo uvolňující ionty), v případě potřeby ke zvýšení adheze k implantovatelným materiálům používaným při kraniofaciální rekonstrukci, fotoiniciátory neštěpícího typu na bázi thiolu (např. eosinY v kombinaci s triethanolaminem a vinylkaprolaktamem) pro umožnění zesíťování aktivovaného viditelným světlem a minimalizaci bezpečnostních obav UV záření. Foto-zesíťování bude dosaženo pomocí přenosného zařízení s viditelným světlem (420-480 nm), aby se vyvolalo želatinace bioinkoustu. Fyzikální vlastnosti (morfologie, viskoelastické vlastnosti, tuhost, odolnost vůči aplikovanému napětí) různých GelMA sloučenin budou analyzovány podle standardizovaných postupů. Adhezivní vlastnosti GelMA budou měřeny zkouškami pevnosti ve smyku a překrytí za sucha. Jakmile budou identifikovány sloučeniny GelMA vykazující nejvyšší biologické vlastnosti, budou vybaveny funkcionalizovanými nanočásticemi (NP) na bázi poly (kyselina mléčná-ko-glykolová) (PLGA).

Za tímto účelem budou syntetizovány biokompatibilní PLGA-polyethylenglykolové (PEG) NP a funkcionalizovány bis-sulfonem pro navázání cílových skupin na povrchu. Syntéza zahrnuje aktivaci PLGA, konjugaci PLGA-PEG, aktivaci bis-sulfonu a konjugaci PLGA-PEG-bis-sulfon. Poměr PLGA/PEG bude upraven pro užitečné zatížení hydrofobnost/hydrofilita. Bis-sulfon se používá pro selektivní a účinnou PEGylaci proteinové disulfidové vazby nebo pro konjugaci His-značeného proteinu/peptidů podle standardizovaných metod pro implementaci buď specifického cílení na buňky nebo antimikrobiálních látek. K ověření biosyntetické reakce bude použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Dynamický rozptyl světla (DLS), analýza sledování nanočástic (NTA) a rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) budou definovat morfologické a ultrastrukturální vlastnosti konečného konstruktu. Surface Plasmon Resonance ověří rozpoznání cíle. Poté bude sestava hybridní směsi GelMA-NP dosažena pomocí vytlačovacího 3D tisku podle standardizovaných výrobních potrubí. Hydrogel a suspenze NP budou dávkovány pomocí samostatných trysek, ve 2D a 3D vzorech s velikostí prvků 100-1000 nm, pod tlakem a teplotou. Skalární koncentrace NP budou použity a následně vyhodnoceny.

Integrita NP a dynamika jejich uvolňování z GelMA budou studovány ponořením GelMA-NP naplněných fluorescenční sloučeninou do biomimetického buněčného růstového média a kvantifikací NP uvolněných v supernatantu v experimentech s časovým průběhem. Kvantifikace NP bude provedena pomocí UV-Vis spektroskopie, fluorescenční spektroskopie nebo počítání částic, jako je systém NTA. Integrita NP bude studována pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM) a DLS.

Jakmile budou biochemicky charakterizovány GelMA-NP, budou použity k dodání bioaktivních sloučenin identifikovaných pomocí proteomických dat, jak bude popsáno dále.

K ověření vyvinutého bioinkoustu na modelech kraniofaciálního onemocnění in vitro budou vybráni a do studie zařazeni pacienti s kraniofaciálními malformacemi podstupujícími kraniální operaci. Konkrétně budou zařazeni dětští pacienti postižení kraniosynostózou a jinými vrozenými vadami, traumaty nebo mozkovými nádory podstupující kraniální operaci. Dospělí pacienti podstupující kraniofaciální operaci budou také vybráni a zařazeni pro kraniofaciální trauma a nádory. Za tímto účelem budou vzorky lebeční kostní tkáně získané od dětských i dospělých pacientů získány jako chirurgický odpad při kraniektomii nebo remodelaci lebeční klenby po získání podepsaného informovaného souhlasu (rodiče v případě dětí). Pro každého pacienta budou odpadní tkáně náhodně rozděleny do tří alikvotů. Z nich bude 1 alikvot odebrán do buněčného růstového média pro naočkování vzorků kostní tkáně na kultivační destičku, aby se izolovaly mezenchymální stromální buňky (MSC). Poté bude MSC rozšířena až do 3. kultivační pasáže a shromážděna v biobankovních infrastrukturách s přidruženými anonymizovanými klinickými daty a optimalizovaným systémem sledování pro následnou analýzu následovně. Uvolňování NP bioinkoustu na bázi GelMA a biokompatibilita bude analyzována pomocí MSC prostřednictvím funkčních testů za účelem: vyhodnocení dynamiky fokální adheze a studia buněčné adheze ke gelovanému bioinku pomocí imunofluorescenčního testu. Chování a životaschopnost buněk bude měřena v experimentech s časovým průběhem pomocí systému zobrazování živých buněk (Incucyte Live Cells Analysis systems).

Kromě toho budou 2 alikvoty vzorků kostní tkáně získané od pacientů bleskově zmraženy v tekutém dusíku (po jeho ponoření do kryoprotektivního média s inhibitory proteázy). Proteiny a metabolity budou izolovány z těchto vzorků pomocí interního standardizovaného protokolu. Extrahované vzorky budou poté štěpeny pomocí protokolu štěpení pomocí filtrem podporované přípravy vzorků (FASP). Poté budou vzorky analyzovány pomocí kapalinové chromatografie tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Také metabolity budou hodnoceny pomocí LC-MS/MS a budou separovány pomocí HPLC. Poté budou získané výsledky týkající se proteinů a metabolitů analyzovány integrovanou analýzou drah (pomocí IPA), aby se dosáhlo multiomického profilování každého pacienta, a tak byly identifikovány cíle, které lze použít při návrhu léků. Výpočtové nástroje pro návrh léčiv, včetně molekulárního dokování a virtuálního screeningu, budou použity k identifikaci hlavních sloučenin z lékových/chemických databází schopných interagovat s vybranými cíli z integrovaných datových souborů omických profilů. Dynamické chování, stabilita a vazebné interakce komplexů cíl-ligand budou studovány pomocí simulací Molecular Dynamics (MD) za účelem analýzy vazebných motivů a aktivních bodů. MD-informované poznatky o molekulárních interakcích budou vodítkem pro návrh a optimalizaci nových sloučenin. To bude zahrnovat začlenění strukturních modifikací s přístupy založenými na ligandu a provádění virtuálního screeningu pro zvýšení vazebné afinity, selektivity a podobnosti s léčivem. Biomolekuly identifikované prostřednictvím těchto studií in silico budou poté komerčně zakoupeny a zapouzdřeny do PLGA NP. V tomto ohledu bude pro hydrofobní užitečné zatížení využívána nanoprecipitace a jednoduchá emulze, zatímco pro hydrofilní užitečné zatížení bude použita technika odpařování rozpouštědel s dvojitou emulzí (w1/o/w2). Poté budou PLGA dodávající vybrané sloučeniny komplexovány do hydrogelové (GelMA) matrice. Funkční trofické a proregenerační vlastnosti bioinkoustové sloučeniny dodávající biomolekuly budou hodnoceny v MSC za účelem testování osteogenních vlastností - prostřednictvím testu aktivity ALP, in vitro mineralizačního barvení a analýzy exprese markerového genu. Kromě toho budou endoteliální buňky lidské pupečníkové žíly (komerční linie) ošetřeny komplexem GelMA-NPs-lék pro hodnocení angiogenních vlastností počítáním a dimenzováním kapilárám podobných struktur vytvořených in vitro (test tvorby trubice).

Dále bude odebrán malý alikvot periferní žilní krve (2-3 ml u dětských pacientů a až 7 ml u dospělých pacientů) z běžných klinických vyšetření. PBMC budou izolovány ze vzorku plné krve pomocí centrifugační techniky s hustotním gradientem Ficoll. Buňky monocytů/makrofágů budou poté separovány pomocí magnetických kuliček konjugovaných s protilátkou CD14 a kultivovány in vitro s faktory (tj. M-CSF, RANKL) k vytvoření zralých osteoklastů. Ty budou použity k hodnocení biologické vstřebatelnosti sloučeniny GelMA-NP. Stručně řečeno, osteoklasty budou naočkovány na povrchy s nanopatterny GelMA-NP a exprese typických markerů specifických pro osteoklasty bude hodnocena pomocí imunofluorescenční analýzy. SEM a imunofluorescenční test budou použity k ultrastrukturální vizualizaci rozhraní osteoklast-bioinkoust a k rozlišení resorpce dvou- a trojrozměrně.

MSC/osteoprogenitory a osteoklasty odvozené od pacientů budou také využity k získání 2D a 3D in vitro kultury k napodobení biologického mikroprostředí existujícího na hranici kost-implantát pro validaci vyvinutého komplexu bioink. Komponenty bioinkoustu budou buď biotiskem s buňkami (tj. buňkami dodávanými přes nezávislou trysku), aby se vytvořily modely nabité buňkami, nebo vytištěny na růstový povrch nádob pro buněčnou kulturu a ponechány zgelovatět před naočkováním buněk, podle cílů každého testu. Dynamika uvolňování NP z GelMA, buněčná životaschopnost a proliferace, angiogenní a kostní regenerační účinky budou hodnoceny, jak je uvedeno výše.

Aby se otestovaly jeho antibakteriální účinky, vyložený GelMA i GelMA-NP se natisknou na Petriho misky a nechají se zgelovatět. Poté bude inkubován s oportunními bakteriálními kmeny (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis a Pseudomonas aeruginosa) ve vhodném kultivačním bujónu přes noc. Bakteriální adheze a počet budou hodnoceny komparativním způsobem, přičemž budou testovány účinky závislé na dávce a čase. Antibakteriální aktivita GelMA-NP oproti GelMA bude také podporována zobrazením SEM.